楊大偉，劉云國 ，譚樂義，周裔斌，祝素珍，王建廣，賈俊濤，姜英輝

(1.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島266002;2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽合肥230000)

食品中A型肉毒梭菌PCR-DHPLC檢測方法的建立

楊大偉1，2，劉云國1，*，譚樂義1，周裔斌2，祝素珍1，王建廣1，賈俊濤1，姜英輝1

(1.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島266002;2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽合肥230000)

目的:建立食品中A型肉毒梭菌的快速檢測方法。方法:應(yīng)用PCR結(jié)合變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)，以A型肉毒梭菌的A型肉毒神經(jīng)毒素基因作為靶基因設(shè)計特異性引物，PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)DHPLC技術(shù)進(jìn)行快速檢測。以非A型肉毒梭菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌等23株參考菌株做特異性實驗;A型肉毒梭菌DNA稀釋成不同梯度，做靈敏度實驗。結(jié)果:與傳統(tǒng)的檢測方法相比，該方法具有很好的特異性，方法靈敏度較高，最低檢出限可達(dá)到為111ng/tube。結(jié)論:該方法可以快速、準(zhǔn)確檢測A型肉毒梭菌，是食品中致病菌快速檢測的新技術(shù)。

變性高效液相色譜，A型肉毒梭菌，PCR，檢測

肉毒梭菌屬革蘭氏陽性厭氧菌，廣泛分布于自然界中，水和土壤中的肉毒梭菌芽孢是造成其食物污染的主要來源［1］。肉毒梭菌代謝產(chǎn)生的肉毒神經(jīng)毒素能夠抑制神經(jīng)末梢乙酰膽堿的分泌，導(dǎo)致運動神經(jīng)和延腦麻痹，根據(jù)其抗原性分為A～G型7個型，其中與人類中毒有關(guān)的是A、B、E、F型，我國報告由肉毒毒素致病的大多為A型毒素［2－4］。目前實驗室中常用的檢測肉毒神經(jīng)毒素的方法是基于抗原－抗體反應(yīng)的針對毒素蛋白的檢測、小鼠致死及中和實驗、膠體金免疫層析法、常規(guī)的PCR檢測等，操作比較復(fù)雜，工作量大［5］。目前分子生物學(xué)方法以及其他一些新技術(shù)則快速靈敏、特異性強(qiáng)，符合當(dāng)前國內(nèi)外對食品安全檢測的要求。變性高效液相色譜(denaturing high—performance liquid chromatography，DHPLC)作為近幾年才發(fā)展起來的新技術(shù)，在一些領(lǐng)域已建立了快速、自動化核酸分析新方法。利用樣品分子通過離子對固定相親和力的差異，在用流動相洗脫時，不同大小或者不同序列的核苷酸片段分子在固定相上移動速率不同而達(dá)到分離的目的［6］。本實驗采用PCR結(jié)合DHPLC方法，為A型肉毒梭菌檢測提供了一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

所用菌種 詳見表1;細(xì)菌基因組DNA小量純化試劑盒、PCRmaster mix TIANGEN;乙腈 色譜純，購自Honeywell公司。

表1 實驗所用菌株

普通PCR儀 Eppendorf AG22331，德國;變性高效液相色譜儀 NAV－99.4500，Transgenomic公司，美國;電泳儀 北京六一儀器廠;凝膠成像系統(tǒng)Vilber Lourmat公司;高速離心機(jī) Centrifuge TGL－16B，Eppendorf公司，德國。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物合成 以A型肉毒神經(jīng)毒素基因作為靶基因，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行檢索，選擇適合的序列，運用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計引物設(shè)計特異性擴(kuò)增引物，用于PCR－DHPLC檢測的引物序列如下:

上游引物:5′－GTTAACATCAATAGTAAGGGGAAT－3′;

下游引物:5′－CCATAACCATTTCGCGTAAG－3′。

引物序列由上海英駿生物工程有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增片段為222bp。

1.2.2 參考菌株模板DNA的建立 按傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法分別增菌培養(yǎng)表1中除肉毒梭菌外的20株參考菌株。取菌株的細(xì)菌培養(yǎng)液1mL，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取細(xì)菌DNA，保存于－20℃?zhèn)溆靡源龣z測，用于特異性實驗。

1.2.3 特異性實驗 以A型肉毒梭菌DNA作為陽性對照，以1.1中參考菌的20種細(xì)菌DNA作為陰性對照，按照1.2.4 PCR擴(kuò)增條件和1.2.5 DHPLC分析條件進(jìn)行病原菌的PCR、DHPLC特異性實驗。

1.2.4 PCR擴(kuò)增條件 PCR反應(yīng)采用20L體系，經(jīng)過優(yōu)化得到的最佳反應(yīng)體系:2×PCRMaster 10μL，引物10μmol/L 各1μL，模板DNA 2μL，加 ddH2O 補(bǔ)足20μL。

最佳反應(yīng)條件:反應(yīng)程序如下:

預(yù)變性: 94℃ 5min

變性: 94℃ 30s退火: 58℃ 60s延伸: }72℃ 60s 40個循環(huán)延長: 72℃ 5min保存: 4℃

1.2.5 DHPLC分析條件 色譜柱:PS.DVB＆C18DNASep色譜柱(4.6min×50mm，粒度3m);柱溫:50℃;流動相:緩沖溶液A濃度為49.9%，緩沖溶液B濃度為 50.1%;流速:0.9mL/min;上樣量:PCR產(chǎn)物5μL。

1.2.6 靈敏度實驗 挑取在37℃培養(yǎng)24h的A型肉毒梭菌菌落，懸浮于3mL0.85%生理鹽水中，10倍梯度稀釋菌液進(jìn)行平板計數(shù)，重復(fù)2次，取平均值確定其菌懸液濃度為7.6×106cfu/mL。采用試劑盒提取法制備模板DNA，提取得到的DNA模板10倍梯度稀釋進(jìn)行PCR－DHPLC檢測，并將上述所得菌懸液10倍梯度稀釋，濃度分別為:1:1.11×108ng/tube;2:1.11×107ng/tube;3:1.11×106ng/tube;4:1.11×105ng/tube;5:1.11×104ng/tube;6:1.11×103ng/tube;7:1.11×102ng/tube;8:1.11×101ng/tube，從而確定反應(yīng)體系的靈敏度。

2 結(jié)果與討論

2.1 特異性實驗

取1.2.2所建立的參考菌株DNA模板進(jìn)行PCR－DHPLC檢測的特異性實驗。圖1為部分菌種的檢測結(jié)果圖譜。經(jīng)PCR－DHPLC檢測，在供試的23株參考菌株中，只有A型肉毒梭菌出現(xiàn)陽性吸收峰，其余所有菌株均呈陰性。實驗結(jié)果表明，本研究自主設(shè)計的A型肉毒梭菌檢測引物具有很好的檢測特異性。

圖1 A型肉毒梭菌特異性實驗的PCR－DHPLC吸收峰圖譜

2.2 靈敏度實驗結(jié)果

將A型肉毒梭菌001的DNA提取液做10n倍比稀釋進(jìn)行PCR－DHPLC檢測，并將所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實驗，并進(jìn)行比對，如圖2所示，實驗結(jié)果表明，DHPLC的最低檢出濃度為111ng/tube，故本研究所建立的方法有很好的檢測靈敏度。

圖2 A型肉毒梭菌靈敏度實驗的PCR－DHPLC吸收峰圖譜

3 討論

常規(guī)的A型肉毒梭菌檢測包括增菌和生理生化鑒定，既耗時又復(fù)雜，不宜做大批量樣本的檢測，隨著生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大，需要大通量的檢測技術(shù)，傳統(tǒng)的檢測方法暴露出種種弊端。而在生產(chǎn)上，由于檢測的時間長可能會導(dǎo)致影響產(chǎn)量和銷量。常規(guī)PCR凝膠電泳檢測技術(shù)雖然檢測成本低，但結(jié)果僅靠凝膠上的條帶大小判斷，如果產(chǎn)物條帶較弱，擴(kuò)增片段大小相差不多時，很難通過肉眼得到準(zhǔn)確結(jié)果。實時熒光PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)，靈敏度高等優(yōu)勢，卻存在檢測成本高、熒光探針保存時間短等不足［7－8］。

PCR結(jié)合DHPLC技術(shù)是新近發(fā)展起來的高靈敏度、高通量檢測新技術(shù)，DNA樣品自動注入，并在緩沖液的攜帶下流經(jīng)DNA分離柱。根據(jù)待檢菌的特有基因序列，設(shè)計 PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)合DHPLC技術(shù)可分離核酸片段的特點，達(dá)到快速、高通量檢測菌的目的［9－10］。本文利用DHPLC能夠吸收檢測DNA片段并具有高度敏感性的特點，針對產(chǎn)A型肉毒神經(jīng)毒素的特異基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用非變性DHPLC技術(shù)，然后利用DHPLC檢測陽性吸收峰，一次可同時自動化分析數(shù)百個樣本，達(dá)到快速檢測的目的，具有廣泛的實際應(yīng)用價值。

［1］Gao Q Y，Huang Y F，Wu J G，et al.A review of botulism in China［J］.Biomed Environmental Sci，1990(3):326.

［2］Hathew ay CL.Botulism:the present status of the disease［J］.Curr Top Microbiol Immunol，1995，195∶55.

［3］王興民，孟筱琦，王成懷.A型肉毒神經(jīng)毒素基因的PCR檢測及A型肉毒梭菌的鑒定［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1997，17(3):176－181.

［4］王穎群，嚴(yán)共華，雷祚榮.PCR檢測產(chǎn)A、B、E、F和G型肉毒神經(jīng)毒素梭菌的神經(jīng)毒素基因［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1997，17(3):182－184.

［5］楊慧盈，王慧，蔭俊，等.A型肉毒神經(jīng)毒素基因的PCR檢測［J］.生物技術(shù)通訊，2006，17(1):37－39

［6］曹際娟，閆平平，于珂，等.變性高效液相色譜檢測霍亂弧菌［J］.遼寧師范大學(xué)學(xué)報，2008，31(3):348－352.

［7］曹際娟，趙昕，孫哲平，等.PCR結(jié)合變性高效液相色譜快速檢測水產(chǎn)品中河流弧菌［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，18(11):2187－2189.

［8］曹際娟，徐君怡，孫哲平，等.變性高效液相色譜高通量檢測動物源性飼料中沙門氏菌和志賀氏菌［J］.飼料工業(yè)，2008，29(14):50－53.

［9］徐君怡，曹際娟，鄭秋月，等.變性高效液相色譜檢測沙門氏菌、空腸彎曲菌和腸出血性大腸桿菌［J］.生物技術(shù)通報，2009(3):127－131.

［10］徐君恰，曹際娟，鄭秋月，等.變性高效液相色譜檢測食品中致瀉性大腸桿菌［J］.微生物學(xué)報，2008，48(11):1526－1531.

Denaturing high performance liquid chromatography
(DHPLC)used in the detection of Clostridium botulinum－A

YANG Da－wei1，2，LIU Yun－guo1，*，TAN Le－yi1，ZHOU Yi－bin2，ZHU Su－zhen1，WANG Jian－guang1，JIA Jun－tao1，JIANG Ying－h(huán)ui1
(1.Shandong Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao 266002，China;2.Anhui Agriculture University，Hefei 230000，China)

Objective:Quick checking method of Clostridium botulinum was established by polymerase chain reaction(PCR)and denaturing high－performance liquid chromatography(DHPLC).Methods:With gene of Clostridium botulinum’type A botulinum neurotoxin as target gene，the primer was designed and PCR system was optimized.And the twenty－three test strains such as Clostridium perfringens were tested by specific detection.Then different grades of standard strain were obtained by diluting and sensitivity was detected.Results:The PCR－DHPLC methods could test Clostridium botulinum exclusively and sensitively which with the lowest amount of detecting was111ng/tube.Conclusion:The PCR－DHPLC method was rapid and accurate in detection of Clostridium botulinum in food.

DHPLC;Clostridium botulinum－A;PCR;detection

TS207.3

A

1002－0306(2011)06－0398－03

2010－04－21 *通訊聯(lián)系人

楊大偉(1984－)，男，碩士在讀，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。

國家質(zhì)檢總局課題(2008IK140，2009IK170)。