陳根洪

(湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

藤茶總多酚的提取及其抗氧化活性研究

陳根洪

(湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

采用溶劑提取法對藤茶總多酚物質(zhì)的提取工藝條件及其抗氧化能力進(jìn)行研究。結(jié)果表明，藤茶總多酚的最佳提取條件為體積分?jǐn)?shù)50%丙酮溶液、料液比1:25(g/mL)、75℃提取1.5h，此時總多酚得率21.82%。藤茶總多酚有較強(qiáng)的還原能力，對超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基均有良好的清除效果，并呈明顯的量效關(guān)系。

藤茶；總多酚；提??；抗氧化

藤茶為顯齒蛇葡萄[Ampelopsis grossedentata(Hand.Mazz)W.T.Wang]的嫩莖葉制成的代用茶，又名甜樹茶、甜茶藤、茅巖霉茶等[1]。顯齒蛇葡萄是葡萄科蛇葡萄屬木質(zhì)藤本藥食兩用植物，廣泛分布于湖南、湖北、福建、廣東和廣西等省區(qū)，該植物總黃酮高，尤以二氫楊梅素含量豐富，我國不同地區(qū)的藤茶總黃酮含量在36%～45%之間[2-5]。目前關(guān)于藤茶功能成分的研究主要集中在藤茶黃酮和多糖方面，有關(guān)藤茶多酚的研究報道不多。

植物多酚具有較強(qiáng)的抗氧化性和清除自由基的能力。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，植物多酚具有良好的抑菌、抗癌、抗氧化等生物活性[6-7]。本實驗對藤茶總多酚的提取及其抗氧化性質(zhì)進(jìn)行初步探討，旨在為藤茶資源的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藤茶 湖北省來鳳縣鳳鳴藤茶公司。

DPPH自由基 日本東京化成工業(yè)株式會社；沒食子酸 天津科密歐化學(xué)試劑公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理及藤茶總多酚提取

經(jīng)粉碎、過20目篩的藤茶粉末，再經(jīng)石油醚脫脂脫色、干燥，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

藤茶總多酚提取工藝：藤茶粉末→回流提取→離心→粗提液→濃縮→放置澄清→離心→藤茶總多酚溶液。

藤茶總多酚提取在對溶劑、溫度、時間和料液比的單因素試驗基礎(chǔ)上，選取時間、溫度和料液比進(jìn)行3因素3水平L9(34)的正交試驗。

1.2.2 藤茶總多酚含量的測定

酒石酸亞鐵比色法[8]。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.5823x＋0.0046。

吸取一定體積的藤茶總多酚溶液于25mL容量瓶中，加入4mL蒸餾水，再加入酒石酸亞鐵溶液5mL，用pH7.5的磷酸緩沖溶液定容，搖勻，在波長540nm處測定吸光度。計算藤茶總多酚得率：

式中：W為藤茶總多酚得率/%；A為樣品的吸光度A540nm；V1為測定時吸取樣品的體積/mL；V2為樣品總多酚溶液定容后的體積/mL；m為藤茶粉末質(zhì)量/g。

1.2.3 藤茶多酚的抗氧化活性研究[9-11]

按1.2.1節(jié)提取工藝路線制備藤茶總多酚溶液(濃縮后的上清液)，測定其總多酚含量，作為抗氧化活性測定的藤茶多酚樣品，放入冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.1 樣品還原能力的測定

取2.5mL樣品液、2.5mL 0.2mol/L PBS(pH6.6)和2.5mL 1% K3[Fe(CN)5]于試管中混勻，在50℃水浴中反應(yīng)20min，速冷后加入2.5mL 10% TCA，混勻后3000r/min離心10min，取5mL上清液，加入1mL 0.1% FeC13混勻，再加4mL蒸餾水搖勻后，以蒸餾水調(diào)零測定吸光度(A700nm)。以VC為陽性對照，藤茶總多酚樣品稀釋液質(zhì)量濃度：0、10、20、30、40、5 0μg/mL。

1.2.3.2 樣品對羥自由基清除率的測定

利用H2O2對Fe2+混合產(chǎn)生·OH，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在波長510nm處有最大吸收。用2mL不同質(zhì)量濃度的總多酚稀釋液加入反應(yīng)體系，再加入H2O2溶液啟動反應(yīng)，37℃反應(yīng)0.5h。以蒸餾水為參比，在波長510nm處測定各質(zhì)量濃度樣品的吸光度(考慮到多酚本身吸光度，以2mL 9mmol/L FeSO4、2mL水楊酸-乙醇溶液及2mL不同質(zhì)量濃度的多酚溶液作為本底吸收)。藤茶總多酚稀釋液質(zhì)量濃度：0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、1.50、2.00mg/mL。

式中：A0為空白對照液的吸光度(用2mL蒸餾水代替多酚溶液)；Ax為加入各樣品的吸光度；Ax0為不加H2O2本底的吸光度(用2mL蒸餾水代替H2O2)。

1.2.3.3 樣品對超氧陰離子自由基清除效果的測定

取4.5mL 50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.2)和4.2mL蒸餾水，混勻后在25℃水浴中保溫20min，取出，立即加入0.3mL 3mmol/L鄰苯三酚(25℃預(yù)熱)，迅速搖勻后在325nm波長處每隔30s測定吸光度，計算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加。測定樣品清除能力時，所取試劑同前，只是在加入鄰苯三酚前，分別加入2mL樣液代替蒸餾水。樣品總多酚稀釋液質(zhì)量濃度：30、40、50、60、70、80、90μg/mL。

式中：A0為鄰苯三酚的自氧化速率；A為加入總多酚樣液后鄰苯三酚的自氧化速率。單位均為每分鐘吸光度的增加值。

1.2.3.4 樣品對DPPH自由基清除率的測定

式中：SA為樣品對DPPH自由基的清除率/%；A0為4mL DPPH-乙醇溶液與4mL 50%乙醇混合液的吸光度；Ai為4mL DPPH-乙醇溶液與4mL樣液反應(yīng)后的吸光度；Aj為4mL樣液與50%乙醇混合液的吸光度。

以上所有試驗處理，均重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 藤茶總多酚提取工藝參數(shù)的確定

2.1.1 溶劑對藤茶總多酚提取效果的影響

在70℃條件下，料液比1:20(g/mL)、時間1h，分別以體積分?jǐn)?shù)50%丙酮溶液、不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液和蒸餾水進(jìn)行提取，結(jié)果如圖1所示。50%丙酮溶液對藤茶總多酚的提取效果最好。多酚是一種極性化合物，溶劑的極性越大，提取效果越好。后續(xù)提取均以50%丙酮溶液為溶劑。

圖1 溶劑對藤茶總多酚提取效果的影響Fig.1 Effect of extraction solvent composition on extraction efficiency of total polyphenols fromAmpelopsis grossedendata

2.1.2 溫度對藤茶總多酚提取效果的影響

在實際施工中，無論SBS改性瀝青AC—20C混合料，還是50#AC—20C混合料，其施工都按照普通AC—20C混合料基本要求進(jìn)行，而對巖瀝青與抗車轍劑，在拌制過程中應(yīng)充分注意具體的添加工藝和拌制時間。因現(xiàn)場拌和樓未設(shè)置添加裝置，并且其產(chǎn)量相對較低，所以現(xiàn)場施工采用直接投放方式，按照標(biāo)準(zhǔn)的順序及要求來執(zhí)行投料與拌制，具體操作方法為：首先，將加熱以后的集料投放至拌和鍋當(dāng)中，從觀察孔向拌和鍋內(nèi)添加巖瀝青或者是抗車轍劑，然后進(jìn)行15s的干拌；然后，投放70#瀝青，進(jìn)行濕拌，持續(xù)23s。

料液比1:20、時間1h，用50%丙酮溶液在不同溫度下進(jìn)行藤茶總多酚提取，結(jié)果如圖2所示。隨著溫度的升高，藤茶總多酚提取得率增加，當(dāng)溫度超過75℃后，提取得率急速下降?？赡艿脑蚴牵阂蛱崛囟瘸^丙酮-水雙液系的沸點，溶液劇烈沸騰產(chǎn)生的氣泡使原料粉末黏附于容器壁上，未能充分被溶劑浸提；另外也可能是由于溫度過高造成多酚分子的結(jié)構(gòu)破壞。選擇75℃進(jìn)行后續(xù)提取試驗。

圖2 溫度對藤茶總多酚提取效果的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction efficiency of total polyphenols fromAmpelopsis grossedendata

2.1.3 提取時間對藤茶總多酚提取效果的影響

料液比1:20、提取溫度75℃，用50%丙酮溶液分別提取不同時間，結(jié)果如圖3所示。藤茶總多酚提取得率隨著提取時間的延長呈上升趨勢，但1、1.5、2h三者間的提取得率相差不大，從省時考慮選擇1h為后續(xù)提取試驗。與1h相比，1.5h的提取得率略有下降，原因尚需進(jìn)一步探討。

圖3 提取時間對藤茶總多酚提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency of total polyphenols fromAmpelopsis grossedendata

2.1.4 料液比對藤茶總多酚提取效果的影響

在75℃條件下，提取時間1h、50%丙酮溶液作溶劑，分別采用不同的料液比進(jìn)行提取，結(jié)果如圖4所示。藤茶總多酚提取得率隨溶劑用量的增加而增加，直到1:25料液比時達(dá)到最大，以后呈下降趨勢。這與常規(guī)提取中所表現(xiàn)的提取得率隨溶劑量增加而保持上升的現(xiàn)象不完全相符，可能與溶劑量過大而致使回流加熱時升溫不均勻有關(guān)。選擇1:25料液比進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖4 料液比對藤茶總多酚提取效果的影響Fig.4 Effect of material/liquid ratio on extraction efficiency of total polyphenols fromAmpelopsis grossedendata

2.1.5 藤茶總多酚最佳提取工藝參數(shù)的優(yōu)選

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以50%丙酮溶液為提取溶劑，進(jìn)行料液比、時間和溫度3因素3水平L9(34)正交試驗，結(jié)果見表1。

表1 提取藤茶總多酚的正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 1 Scheme and experimental results of orthogonal array design

極差分析顯示，影響藤茶總多酚提取效果的3因素主次關(guān)系為提取時間＞提取溫度＞料液比，最佳工藝組合為A2B3C3，即料液比1:25、時間1.5h、溫度75℃。

在最佳工藝條件下進(jìn)行3次平行實驗，藤茶總多酚得率平均為21.82%，與正交試驗結(jié)果相符。

2.2 藤茶總多酚抗氧化活性的研究

2.2.1 藤茶總多酚的還原能力

VC是良好的抗氧化劑。由圖5可知，在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨VC質(zhì)量濃度的增加，還原能力逐漸增大，而藤茶總多酚溶液在與VC相同質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其還原能力高于VC，說明藤茶多酚提取物具有較強(qiáng)的還原能力。

圖5 VC和藤茶總多酚還原能力的比較Fig.5 Comparison of reducing power between total polyphenols fromAmpelopsis grossedendataand vitamin C

2.2.2 藤茶總多酚對羥自由基的清除作用

羥自由基是已知的最強(qiáng)氧化劑，對生物細(xì)胞和組織的破壞作用最大。藤茶總多酚對H2O2-Fe2+體系產(chǎn)生的羥自由基的清除效果如圖6所示。藤茶總多酚對H2O2-Fe2+體系產(chǎn)生的羥自由基清除作用明顯，并且隨著反應(yīng)體系中藤茶總多酚質(zhì)量濃度的增大，清除能力增強(qiáng)。表明藤茶總多酚對羥自由基的清除能力與其質(zhì)量濃度具有明顯的量效關(guān)系。

圖6 藤茶總多酚對·OH的清除作用Fig.6 Scavenging capability of total polyphenols fromAmpelopsis grossedendataon hydroxyl free radicals

2.2.3 藤茶總多酚對超氧陰離子自由基的清除作用

圖7 藤茶總多酚對O2-·的清除作用Fig.7 Scavenging capability of total polyphenols fromAmpelopsis grossedendataon superoxide anion free radicals

2.2.4 藤茶總多酚對DPPH自由基的清除效果

DPPH自由基是一種人工合成的穩(wěn)定自由基，其乙醇溶液呈紫色，在波長517nm處有較強(qiáng)吸收，當(dāng)DPPH自由基溶液中加入能清除自由基的樣品時，在波長517nm處吸光度變小，其減小程度與自由基清除效果相關(guān)，如圖8所示。藤茶總多酚對DPPH自由基清除效果明顯，并隨藤茶總多酚濃度增大，清除能力增強(qiáng)，呈明顯的量效關(guān)系。

圖8 藤茶總多酚對DPPH自由基的清除效果Fig.8 Scavenging capability of total polyphenols fromAmpelopsis grossedendataon DPPH free radicals

3 討論與結(jié)論

溶劑法提取藤茶總多酚的最佳工藝條件為以50%丙酮溶液作提取溶劑、料液比1:25、時間1.5h、溫度75℃，此時藤茶總多酚提取得率可達(dá)21.82%。藤茶總多酚具有較強(qiáng)的還原能力，對羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基均有較好的清除效果，并表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。

據(jù)文獻(xiàn)報道，藤茶富含二氫楊梅素等黃酮類物質(zhì)，具有重要的生物活性[2,4-5,12]，還富含黃酮類物質(zhì)以外的多酚類物質(zhì)[8]。本實驗初步探討了藤茶總多酚的提取工藝與生物活性，關(guān)于藤茶總多酚的分離純化以及具有生物活性的有效成分的鑒定尚需要進(jìn)一步研究。

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Extraction and Antioxidant Activity of Total Polyphenols fromAmpelopsis grossedendata

CHEN Gen-hong
(Institute of Bioscience and Technology, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China)

The extraction and antioxidant activity of total polyphenols fromAmpelopsis grossedendatawere studied in this paper. The optimal extraction conditions were achieved to be extraction at 75 ℃ for 1.5 h with a 25-fole volume of 50% acetone aqueous solution as the extraction solvent. Under the optimal extraction conditions, the yield of total polyphenols was 21.82%.Total polyphenols fromAmpelopsis grossedendatashowed high reducing power and excellent scavenging effect on hydroxyl,superoxide anion and DPPH free radicals in a dose-dependent manner.

Ampelopsis grossedendata；total polyphenols；extraction；antioxidant activity

TS201.2

A

1002-6630(2011)06-0127-04

2010-06-28

湖北省自然科學(xué)基金項目(2006ABA036)；湖北省科技廳創(chuàng)新團(tuán)隊項目(2009CDA155)

陳根洪(1968—)，男，副教授，碩士，研究方向為天然產(chǎn)物與食品貯藏保鮮。E-mail：chengh6872@163.com