曹運珠 魏東明 任冬雪 陳 晨 邢永恒,* 施 展

(1遼寧師范大學化學化工學院,遼寧大連116029;2吉林大學化學學院,無機合成與制備化學國家重點實驗室,長春130012)

釩鹵代過氧化物酶構象模型分子的設計、合成及仿生催化活性

曹運珠1魏東明1任冬雪1陳 晨1邢永恒1,*施 展2

(1遼寧師范大學化學化工學院,遼寧大連116029;2吉林大學化學學院,無機合成與制備化學國家重點實驗室,長春130012)

基于釩鹵代過氧化物酶(V-HPOs)活性中心的N、O配位環(huán)境及活性中心與氨基酸殘基、水分子之間的氫鍵作用的模擬,我們設計、合成了兩種釩氧配合物:(C3H5N2)2[(VO)2(μ2-C2O4)(C2O4)2(H2O)2](1)和(VO2)2(μ2-C2O4)(C3H4N2)2(2),并通過X射線單晶衍射方法確定了它們的結構.晶體結構分析表明上述釩氧配合物的配位環(huán)境與(V-HPOs)活性中心十分相似,且在配合物的三維堆積結構中具有類α-螺旋結構.溴化反應活性研究發(fā)現(xiàn)這些釩氧配合物在仿生催化實驗中表現(xiàn)出較高的催化活性.

釩鹵代過氧化物酶; 釩氧配合物; 晶體結構;α-螺旋; 分子構象

Abstract: Based on mimicing the N,O coordination environment of the active center of vanadium haloperoxidase(V-HPOs)and the hydrogen-bond interaction between the active center and amino acid residues or water molecules,we designed and synthesized two kinds of oxidovanadium complexes:(C3H5N2)2[(VO)2(μ2-C2O4)(C2O4)2(H2O)2](1)and(VO2)2(μ2-C2O4)(C3H4N2)2(2).We determined their structures by X-ray single crystal diffraction.The crystal structure analysis indicated that the coordination environments of those oxidovanadium complexes were similar to the active center of vanadium haloperoxidase,and there seemed to be a mimicingα-helix structure in the three-dimensional packing structure of the complexes.Additionally,by studying the bromination reaction activity we found that the oxidovanadium complexes had an upper activity during the mimic catalytic process.

Key Words:Vanadium haloperoxidase;Oxidovanadium complex;Crystal structure;α-Helix;Molecule conformation

1 引言

1984年Vilter1發(fā)現(xiàn)釩是褐藻(Ascophyllum nodo-sum)分泌的溴化過氧化酶中必需元素,1995-1996年Messerschmidt和Wever2,3通過X射線單晶衍射方法確定了釩溴過氧化物酶(V-BrPO)及釩氯過氧化物酶(V-ClPO)的結構.兩種過氧化物酶的活性中心都呈現(xiàn)氨基酸序列的高度同系現(xiàn)象,結構與圖1相似.4-6活性中心的釩(V)與鄰近的組氨酸咪唑基上的N共價鍵合,釩周圍的氧則與氨基酸中的氫形成氫鍵,整體呈現(xiàn)三角雙錐構型.7以酶活性中心的結構為基礎,合成簡單高效的類酶化合物一直是科學家們研究的熱點.8-10近二十年來合成的幾類釩鹵代過氧化物酶(V-HPOs)模型為:11-16(i)V(V)和V(IV)與希夫堿類配體形成的配合物;(ii)過氧化釩配合物;(iii)釩-三角胺類模型配合物,它們都只是做到模擬釩鹵代過氧化物酶(V-HPOs)部分結構而已,且催化活性不理想,毒性大,所以仍需要我們對該酶模型的合成和機理進行進一步探索.

酶作為功能性分子以及千變萬化的空間構象為其行使催化功能奠定了基礎.17,18這讓我們在設計合成酶模型化合物時,不但要模擬活性中心配位微環(huán)境,還要考慮模擬酶的空間結構.為此本文選定含氮、氧的小分子做配體,一方面模擬活性中心的金屬與氮氧的配位鍵,另一方面可以通過較多的氧原子形成更多的氫鍵模擬酶的多級結構.在常溫條件下，水醇體系中首次獲得配合物1和2,并對上述配合物進行仿生溴化實驗及催化動力學研究.

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

JASCO FT/IR-480型傅里葉變換紅外光譜儀(JASCO日本分光公司,日本)(200-4000 cm-1,KBr壓片);PE 240C型元素分析儀(PE公司,美國);Bruker AXS SMARTAPEX II CCD型X射線單晶衍射儀(Bruker公司,德國);紫外可見光譜用PE Lambda 35型光譜儀(PE公司,美國)和721分光光度計(上海第三分析儀器廠)測定.VOSO4·nH2O(上海綠源精細化工廠),分析純;NH4VO3(沈陽市試劑二廠),分析純;吡唑(百靈威化學品公司),分析純;草酸(百靈威化學品公司),分析純;咪唑(百靈威化學品公司),分析純;甲醇、乙醇(天津市化學試劑三廠),分析純;苯酚紅(天津市化學試劑一廠),分析純;溴化鉀(自貢制藥廠),分析純;過氧化氫(遼寧永強醫(yī)藥器械化玻有限公司試劑一廠),分析純;磷酸氫二鈉(汕頭市金砂化工廠),分析純;磷酸二氫鈉(沈陽市試劑三廠),分析純.

2.2 配合物的合成

2.2.1 配合物(C3H5N2)2[(VO)2(μ2-C2O4)(C2O4)2(H2O)2](1)的合成

將草酸(0.09 g,1 mmol)和咪唑(0.042 g,0.6 mmol)溶于10 mL乙醇中,加入VOSO4·nH2O(0.14 g,VOSO4的純度為71%,0.6 mmol)的5 mL水溶液,用濃鹽酸調pH值到2,室溫攪拌4 h,得到藍色溶液,過濾,所得濾液在室溫條件下放置,兩周后有藍綠色晶體析出.稱重0.12 g,產(chǎn)率:69.9%(以VOSO4中的釩為基準).元素分析(C12H14N4O16V2)測定值(%):C,24.78;H,2.40;N,9.58,理論值(%):C,25.19;H,2.46;N,9.79.

2.2.2 配合物(VO2)2(μ2-C2O4)(C3H4N2)4(2)的合成

將草酸(0.045 g,0.5 mmol)和吡唑(0.14 g,2 mmol)溶于10 mL甲醇中,加入NH4VO3(0.12 g,1 mmol)的水溶液,室溫4 h,得到黃綠色濁液,過濾,所得黃綠色濾液放置幾天后從母液中析出黃綠色晶體.稱重0.14 g,產(chǎn)率:53.2%(以NH4VO3中的釩為基準).元素分析(C14H16N8O8V2)測定值(%):C,31.11;H,3.12;N,21.18,理論值(%):C,31.95;H,3.06;N,21.29.

2.3 配合物的晶體結構分析

選擇晶體大小為0.19 mm×0.12 mm×0.08 mm配合物1和大小為0.14 mm×0.13 mm×0.12 mm配合物2的單晶,分別在Bruker SmartAPEX II CCD儀器上,Mo Kα光源(λ=0.071073 nm),室溫下收集衍射數(shù)據(jù).對配合物1,共收集到3756個衍射點,其中獨立衍射點1240個,強點920個(I>2σ(I))用于結構解析;對配合物2,共收集到5165個衍射點,其中獨立衍射點1738個,強點1266個(I>2σ(I))用于結構解析.衍射強度數(shù)據(jù)經(jīng)Lp因子校正.晶體結構由直接法和差值Fourier合成法解出,對所有非氫原子坐標和各向異性溫度因子進行全矩陣最小二乘法修正.氫原子坐標由理論加氫程序確定.所有計算均用SHELX-97程序在Pentium(III)PC計算機上進行.配合物1和2的晶體學參數(shù)列于表1,配合物1和2的分子結構及分子間弱的相互作用在SHELX-97程序和Diamond 2.1c程序中畫出.

2.4 催化活性研究

苯酚紅能在過氧化氫存在下結合溴離子形成溴酚藍,通過測定生成物的吸光度變化可以分析配合物的催化活性.主要進行以下兩個實驗:(i)在恒溫條件下,將反應物溶于水溶液中,用磷酸緩沖液保持pH=5.8,根據(jù)苯酚紅特征吸收波長443 nm及溴酚藍特征吸收波長595 nm處吸光度的變化來跟蹤反應過程，實驗條件為磷酸緩沖液(pH=5.8),KBr(0.4 mol·L-1),H2O2(1mmol·L-1),苯酚紅(0.01mmol·L-1);(ii)通過測定不同濃度釩配合物催化下溴酚藍吸光度隨時間的變化關系計算反應速率,再通過反應速率與配合物濃度的關系,求得反應級數(shù),實驗條件為磷酸緩沖液(pH=5.8),KBr(0.4 mol·L-1),H2O2(1 mmol·L-1),苯酚紅(0.02 mmol·L-1).配合物2的溴化催化活性研究方法與配合物1相同.

表1 配合物1和2的晶體學及結構精修數(shù)據(jù)Table 1 Crystallographic data and structure refinement for complexes 1 and 2

3 結果與討論

3.1 配合物的合成及性質

配合物1和2都是在室溫下水醇體系中通過自組裝方法合成的,使用的釩源為VOSO4·nH2O和NH4VO3,兩種晶體均是室溫下反應液自然揮發(fā)得到.配合物1和2都易溶于水、甲醇等溶劑,而在乙醚、正己烷中難溶.

3.2 配合物的紅外光譜

配合物1的紅外光譜:峰位在3154 cm-1處的吸收峰歸屬為咪唑環(huán)上的N―H伸縮振動;羧基不對稱性伸縮振動峰(νas(COO-))和其對稱性伸縮振動峰(νs(COO-))分別出現(xiàn)在1652和1418 cm-1處;V＝O的特征峰在984 cm-1處;19V―O的振動峰出現(xiàn)在384 cm-1處.

配合物2的紅外光譜:峰位在3150 cm-1的吸收峰歸屬為吡唑環(huán)上的N―H伸縮振動;羧基不對稱性伸縮振動峰(νas(COO-))和其對稱性伸縮振動峰(νs(COO-))分別出現(xiàn)在1652和 1355 cm-1處;V＝O的特征峰在888,903,916,935 cm-1處;20V―N和V―O的振動峰分別出現(xiàn)在425和365 cm-1處.

3.3 配合物的結構描述

配合物1的分子由C3H5N2+和[(VO)2(μ2-C2O4)(C2O4)2(H2O)2]2-構成.[(VO)2(μ2-C2O4)(C2O4)2(H2O)2]2-結構如圖2a所示,主要鍵長、鍵角列于表2.從圖2a可以看出,中心釩原子與兩個草酸上的O原子(O1,O4,O5,O6)、端氧原子(O2)及水中的氧原子(O3)配位,并通過草酸分子橋聯(lián)形成雙核配合物.以中心釩原子、端氧原子(O2)及橋聯(lián)草酸中的一個氧原子(O6)為軸形成VO6八面體配位構型.其中,O1、O3、O4、O5四個氧原子位于赤道平面,而O2和O6分別位于配位平面兩側的0.1899(2)和-0.1935(3)nm處.配合物1中,以橋聯(lián)草酸配體中的C―C鍵中點為對稱中心形成軸向反式雙八面體,即八面體的赤道平面與橋聯(lián)草酸平面垂直.V原子與赤道平面的氧原子所形成的V―O1、V―O3、V―O4和V―O5鍵長分別為 0.2072(4)、0.2044(4)、0.1970(4)和 0.2000(4)nm,表明這四個鍵均為單鍵且這與V-BrPO中的V―O鍵長(0.1930 nm)相近,4而軸向V―O2的鍵長為0.1587(4)nm,表明此鍵有雙鍵特征并與V-BrPO中的V＝O鍵長(0.1600 nm)相近,4V―O6的鍵長為0.2267(4)nm,明顯大于其它釩氧鍵長,這是由于V―O6鍵處在端氧的反位,受端氧的反位作用影響所致.配位平面上的四個鍵角O1―V―O3、O1―V―O5、O3―V―O4、O4―V―O5分別為93.86(17)°、92.16(17)°、86.98(19)°、81.28(18)°,軸向O2―V―O6鍵角為168.5(2)°,可見,在釩氧配合物中,釩原子處于略微畸變的八面體配位環(huán)境中.配合物1中的氧原子與配位水及咪唑陽離子中的氫原子形成分子間氫鍵,從而形成三維氫鍵結構,詳細的氫鍵鍵長、鍵角列于表3.配合物1結構特征中除了擁有較多類似V-BrPO中的V—O與周圍氨基酸形成的氫鍵外,還應該注意的是,該配合物在ab平面內可形成類似酶分子的二級結構中的α-螺旋結構(圖3a),而鏈與鏈之間可通過與咪唑陽離子的氫鍵作用相互連接(圖3b),這與酶的三級結構非常相似.配合物1類生物分子的結構使其在仿生溴化方面體現(xiàn)出較高的活性.

表2 配合物1的主要鍵長和鍵角Table 2 Selected bond lengths and angles for complex 1

表3 配合物1的氫鍵參數(shù)Table 3 Parameters of hydrogen bonds of complex 1

配合物2的分子結構如圖2b所示,主要鍵長、鍵角列于表4.從圖2b可以看出,中心釩原子與兩個吡唑環(huán)上的N原子(N1,N3)、兩個端氧原子(O1,O2)及草酸根中的兩個氧原子(O3,O4)配位,通過草酸分子橋聯(lián)形成雙核配合物,每個核都以端氧原子(O2)及橋聯(lián)草酸中的一個氧原子(O4)為軸形成VN2O4八面體配位構型,這與配合物1的結構相似.其中,N1,N3,O1,O3四個原子位于赤道平面,而O4和O2分別位于配位平面兩側的0.1984(8)和-0.1857(6)nm處.V原子與赤道平面原子所形成的V―O1、V―O3、V―N1和V―N3鍵長分別為0.1606(5)、0.2180(5)、0.2080(6)和0.2070(6)nm,軸向配位鍵V―O2和V―O4鍵長為0.1607(5)和0.2282(5)nm,其中V―N平均鍵長為0.2075(6)nm,這與V-BrPO中的V―N鍵長(0.2110 nm)相近,21而釩氧鍵分為兩類,一類是具有雙鍵特征的釩端氧鍵(V―Ot),其長度與V-BrPO中的V＝O鍵長(0.1600 nm)相似,而另一類釩氧鍵(V―Ooxalate)平均鍵長為0.2231(5)nm,表明此類鍵為單鍵.配位平面上的四個鍵角O1―V―N1、O3―V―N1、O1―V―N3、O3―V―N3分別為 94.1(2)°、82.9(2)°、95.1(2)°和 83.8(2)°,軸向O2―V―O4鍵角為163.5(2)°,可見,釩原子處于畸變的八面體配位環(huán)境中.配合物2與配合物1相比只存在a軸向和c軸向的氫鍵鏈,并在ac平面由氫鍵構成網(wǎng)狀結構.配合物2分子間氫鍵鍵長、鍵角數(shù)據(jù)列于表5.

表4 配合物2的主要鍵長和鍵角Table 4 Selected bond lengths and angles for complex 2

表5 配合物2的氫鍵參數(shù)＊Table 5 Parameters of hydrogen bonds of complex 2＊

3.4 釩氧配合物的催化活性

以苯酚紅為有機底物,在過氧化氫存在的條件下結合溴離子形成溴酚藍,反應過程如下:

將一定量的配合物2加入到含有溴離子的苯酚紅溶液中,用磷酸緩沖溶液使pH保持5.8,待反應液在常溫下反應30 min后,每隔10 min測定一次吸光度與波長的曲線.從紫外光譜可以觀察到在595 nm處產(chǎn)物溴酚藍的吸收峰逐漸增強,而在443 nm處反應物苯酚紅的吸收峰逐漸減小,表明催化反應已經(jīng)發(fā)生(圖4).22配合物1代替配合物2也得到相同變化的曲線圖,說明配合物1同樣具有催化性質.

苯酚紅(R-H)的溴化反應方程式可以表示為:Br-+H2O2+R-H+H+→RBr+2H2O,23,24當有釩配合物存在時,將提高過氧化氫的活度,從而起到催化作用.不同釩配合物受配位環(huán)境、價態(tài)及空間構象等因素影響,在活化過氧鍵時體現(xiàn)出不同催化活性.由于整個溴化反應非常復雜,導致研究不同釩配合物對催化反應的影響難度增大,但是當固定苯酚紅、溴離子、過氧化氫及氫離子濃度時,苯酚紅溴化反應的反應速率只受釩配合物的濃度影響,其反應速率表達式可以簡化為:dCRBr/dt=kCVxb(C代表濃度,V代表釩配合物,x表示釩配合物的反應級數(shù),k反應速率常數(shù),b值的大小由苯酚紅、溴離子、過氧化氫及氫離子濃度共同決定).25,26將該式取對數(shù)得:lg(dCRBr/dt)=lgk+xlgCV+lgb,因此,反應速率只是釩配合物濃度的函數(shù).配制系列不同濃度的釩配合物溶液,以lg(dCRBr/dt)對配合物濃度的對數(shù)作圖,所得直線的斜率,即為釩配合物的反應級數(shù).根據(jù)比爾定律:A=εdC(ε為吸光系數(shù),d為樣品池光徑長度),以吸光度A對時間t作圖,其斜率應為εd(dCRBr/dt),測得595 nm處溴酚藍的ε為14500 L·mol-1·cm-1(pH=5.8),d為1 cm,計算得出反應速率.用Origin 7.0程序,根據(jù)配合物1的吸光度(A)與時間(t)的變化關系,利用線性回歸函數(shù)計算直線的斜率,得出配合物1在此濃度下的反應速率dCRBr/dt.改變配合物1的濃度,得到一系列直線(圖5A).以lg(dCRBr/dt)對配合物1的濃度的對數(shù)(lgCV)作圖(圖6a),線性回歸方程為:y=0.99585x-1.70369.配合物2按照上述方法得到不同濃度時吸光度與時間的變化曲線(圖5B)及反應速率對數(shù)lg(dCRBr/dt)對濃度的對數(shù)(lgCV)的曲線(圖6b),線性回歸方程為:y=1.01099x-2.43502.上述兩個方程斜率都接近于1,說明對于配合物1和2,此反應都為一級反應.但是兩個方程的截距不同,且截距為lgk+lgb,而b為定值,所以配合物1與配合物2的截距差值Δlgk=0.73133,說明配合物1的反應速率常數(shù)是配合物2的5倍.雖然配合物1與配合物2都具有部分類酶結構,但是催化活性卻存在較大差異,這說明配合物的催化能力不僅受金屬的配位環(huán)境影響,還會受到配合物空間構象的影響.晶體結構分析表明配合物1具有類似釩鹵代過氧化物酶(V-HPOs)空間構象的結構,這也是其具有更高催化活性的主要原因.

4 結論

釩鹵代過氧化物酶(V-HPOs)是具有三維空間特征的分子實體,且酶的空間結構又是其功能的結構基礎.本文以簡單的羧酸配體與咪唑、吡唑相組合,模擬釩鹵代過氧化物酶(V-HPOs)活性中心的配位環(huán)境,合成具有部分類酶結構的釩氧配合物.通過X射線單晶衍射數(shù)據(jù)可以看出,釩氧配合物不僅具有與酶活性中心相似的配位環(huán)境，還具有較多的氫鍵種類,可以進一步模擬酶的二級及三級空間構象.以苯酚紅為有機底物對釩配合物進行仿生溴化研究,動力學數(shù)據(jù)分析表明在模擬酶活性中心的配位環(huán)境的基礎上,合成具有類酶空間結構的配合物將具有更好的催化活性.

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Design,Synthesis and Mimic Catalytic Activity of a Vanadium Haloperoxidase Conformation Model Molecule

CAO Yun-Zhu1WEI Dong-Ming1REN Dong-Xue1CHEN Chen1XING Yong-Heng1,*SHI Zhan2
(1College of Chemistry and Chemical Engineering,Liaoning Normal University,Dalian 116029,Liaoning Province,P.R.China;2State Key Laboratory of Inorganic Synthesis and Preparative Chemistry,College of Chemistry,Jilin University,Changchun 130012,P.R.China)

O641;O643

Received:October 20,2010;Revised:January 7,2011;Published on Web:February 16,2011.

?Corresponding author.Email:yhxing2000@yahoo.com;Tel:+86-411-82156987.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(21071071),Education Foundation of Dalian City,China

(2009J21DW004),and State Key Laboratory of Inorganic Synthesis and Preparative Chemistry,College of Chemistry,Jilin University,China(2010-15).

國家自然科學基金(21071071),大連市教育基金(2009J21DW004)及吉林大學無機合成與制備化學國家重點實驗室(2010-15)資助