倪偉,才學鵬,喬軍,孟慶玲,陳創(chuàng)夫,任艷

(1石河子大學動物科技學院預防獸醫(yī)學重點實驗室,石河子832003;

2中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室,蘭州730046)

小反芻獸疫病毒融合蛋白基因的克隆、序列分析及表達

倪偉1,2,才學鵬2,喬軍1,孟慶玲1,2,陳創(chuàng)夫1,任艷1

(1石河子大學動物科技學院預防獸醫(yī)學重點實驗室,石河子832003;

2中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室,蘭州730046)

根據(jù) GenBank報道的小反芻獸疫病毒(PPRV)融合蛋白(F)基因序列,用特異性引物對 PPRV疫苗株F蛋白基因進行了RT-PCR擴增,并將其克隆到p GEM-T載體中進行測序。結果表明:F基因ORF全長1641 bp,編碼546個氨基酸;推導的氨基酸序列中第1～18位氨基酸構成信號肽序列,第488～510氨基酸為跨膜區(qū)。構建原核表達載體pETF1和pETF2,轉化 E.coliBL21(DE3),用 IPTG誘導表達。SDS-PAGE和Western-blotting的分析結果表明,F1和F2基因在大腸桿菌中均獲得了表達,且均具有良好的反應原性。用Ni-NTA試劑盒純化F1和F2重組蛋白,為研發(fā)檢測PPRV特異性抗體的診斷試劑奠定了基礎。

小反芻獸疫病毒;融合蛋白基因;克隆;原核表達

小反芻獸疫是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminantsvirus,PPRV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病[1-2]。該病嚴重危害山羊和綿羊等反芻動物,其發(fā)病率可達80%～100%,嚴重暴發(fā)期時的病死率為100%,被世界動物衛(wèi)生組織列為A類動物疫病,在我國被列為一類動物傳染病。近年來,該病流行范圍有不斷擴大的趨勢[3-4]。因此,有必要加強我國邊境地區(qū)動物血清學檢測和監(jiān)測。

目前,雖然國內外已經建立了診斷該病的瓊脂糖凝膠免疫擴散、對流免疫電泳、間接熒光抗體試驗、病毒微量中和試驗、免疫捕獲ELISA等,但這些方法或操作復雜費時或靈敏度、特異性不高或沒有商品化的試劑盒,這給基層單位PPR流行病學調查與監(jiān)測帶來了較大困難。鑒于此,建立一種特異、敏感、快速檢測方法勢在必行。

由于我國過去一直屬于小反芻獸疫非疫區(qū)國家,因此缺乏對于該病的診斷及監(jiān)測試劑的研發(fā),這給該病的防控帶來困難。融合蛋白(F)是PPRV的主要結構蛋白之一,位于 PPRV病毒囊膜的表面,它既是PPRV感染宿主細胞的關鍵蛋白也是誘導機體產生中和抗體的保護性抗原[5-6]。為了研制PPRV特異性檢測用抗原,本研究采用基因工程手段表達PPRV F蛋白,以期為建立檢測PPRV特異性抗體的診斷試劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞和載體

大腸桿菌感受態(tài)細胞 E.coliJM109、E.coli BL21(DE3)和表達載體pET-28a(+)均為本室保存。p GEM-T載體試劑盒購自Promega公司。

1.2 主要試劑

Taq plus DNA 聚合酶、DNA Marker、辣根過氧化物酶標記兔抗山羊 HRP-IgG,購自北京天根生化科技有限公司。DNA回收試劑盒、AMV反轉錄酶、RNA酶抑制劑、限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ、HindⅢ,購自 Promega公司。Ni-NTA蛋白純化試劑盒購自Qiagen公司。PPRV疫苗株總RNA和山羊抗PPRV陽性血清由中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈。

1.3 PPRV F蛋白基因的RT-PCR擴增與克隆

RT反應:20μL反應體系。取 PPRV疫苗株總RNA加入AMV 5×buffer 4μL、RNA酶抑制劑1μL 、2.5 mmol/L dNTP 4μL 、OligodT 1μL 、10 U/μL AMV 反轉錄酶 5 U、ddH2O 9.5μL,于 42 ℃反應1 h。

PCR擴增:根據(jù) GenBank中已有的 PPRV全基因組序列(登錄號:AJ849636),用 Primer 5.0軟件設計P1和P2引物:

PCR采用50μL反應體系,體系組成為:10×反應緩沖液(含 15 mmol/L MgCl2)5μL,dNTP(2.5 mmol/L)4μL,上游引物 P1(25μmol/L)1 μL,下游引物 P2(25μmol/L)1μL,模板(反轉錄的cDNA)10μL,Taq plus酶 1.5 U,補水至 50μL。

PCR反應條件:96℃200 s;94℃45 s,58℃45 s,72℃2 min,35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。

PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。用DNA回收試劑盒回收PCR產物,與p GEM-T載體4℃過夜連接,次日轉化 E.coliJM109感受態(tài)細胞,在氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng),用藍白斑和 PCR方法篩選陽性克隆(命名為p TF),隨機選取3個鑒定正確的陽性克隆送上海生物工程有限責任公司進行序列測序。

1.4 原核表達載體pETF1和pETF2的構建

根據(jù)測定的F基因序列,分析其推導的氨基酸序列,選擇 F1(第438～911位核苷酸)和 F2(第 921～1388位核苷酸)編碼抗原表位集中的區(qū)域,分別用P3-P4和P5-P6引物,以pTF為模板進行擴增。

分別回收 F1和 F2基因,用限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ對 F1基因進行雙酶切,用限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ對F2基因進行雙酶切,然后將酶切后的F1和F2片段分別于用相應限制性內切酶處理的pET-28a(+)載體連接,分別用兩種連接產物轉化 E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞。轉化后的BL21細胞涂于含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上,37℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落進行搖菌,提取質粒,進行PCR和雙酶切鑒定。

1.5 F1和F2基因的誘導表達及純化

將鑒定正確的重組載體轉化 E.coliBL21(DE3)表達菌,37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值約為0.6,加入終濃度為1.5 mmol/L IPTG進行誘導表達,并進行 SDS-PA GE電泳分析。將SDS-PAGE電泳凝膠電轉至硝酸纖維薄膜上,以山羊抗 PPRV陽性血清為一抗,HRP標記的兔抗山羊 IgG為二抗,進行Western-blotting分析。用Ni-N TA蛋白純化試劑盒,按照試劑盒說明書進行 F1和 F2蛋白的純化,將最后的洗脫液進行SDS-PA GE電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 PPRV F基因的擴增與克隆結果

經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析的結果(圖1)表明,PCR擴增產物大小約為1650 bp,與預期大小相符。圖2顯示,以重組載體p TF為模板,可以擴增與與預期大小一致的目的基因片段;限制性內切酶EcoRⅠ、XhoI和 HindIII酶切p TF,酶切片段大小與預期結果一致。

圖1 PPRV F基因的擴增Fig.1 Amplification of F gene of PPRV

圖2 重組載體pTF的酶切鑒定Fig.2 Identification of pTF by restriction endonuclease digestion

2.2 PPRV F基因的測序及序列分析

1641 bp,編碼546個氨基酸(圖3)。

經測序,PPRV疫苗株F蛋白cDNA ORF全長

圖3 PPRV F蛋白基因cDNA序列及其推導的氨基酸序列Fig.3 cDNA sequence of F gene of PPRV and it’s deduced amino acid sequence

將圖3與 GenBank登錄的 Turkey 2000毒株相比,F基因存在2個不同的變異位點(第222位A→T,第963位核苷酸G→T),但均為同義突變。運用Signal IP和TMHMM軟件分析發(fā)現(xiàn),推導的氨基酸序列中第1～18位氨基酸構成信號肽序列,第488～510位氨基酸殘基為跨膜區(qū)。Prosite軟件分析發(fā)現(xiàn),推導的F蛋白上有3個潛在的N-聯(lián)糖基化位點(25～28、57～60、63～66)、9 個蛋白激酶C磷酸化位點(38～40、106～108、145～147、216～218、358～360、372～374、413～415、482～484、538～540)、9 個酪蛋白激酶 II磷酸化位點(59～62、65～68、148～151、216～219、248～251、266～269、283～286、323～326、464～467)、2 個酪氨酸激酶磷酸化位點(240～247、431～438)、15個N-豆蔻?；稽c(30～35、33～38、111～116、116～121、120～125、235～240、336～341、352～362、369～374、380～385、456～461、460～465、485～490、501～506、537～542),1 個酰胺化位點(102～105)。氨基酸序列分析結果提示,F蛋白需要經過糖基化和磷酸化后才能發(fā)揮其生物學功能。

2.3 原核表達載體pETF1和pETF2鑒定結果

圖4 重組載體pETF1和pETF2的PCR鑒定Fig.4 Identification of recombinant pETF1 and pETF2 by PCR

以pETF1和pETF2為模板,分別用 P3-P4和P5-P6引物對其進行擴增,結果擴增的基因片段與F1和F2基因大小相符,分別為473 bp和468 bp(圖4)。用限制性內切酶雙酶切鑒定,結果得到了與預期一致的結果。

2.4 F1和 F2基因的表達及Western-blotting分析

將轉化pETF1和pETF2質粒的 E.coliBL21(DE3)重組菌用IPTG誘導培養(yǎng),SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)在誘導后出現(xiàn)了2條相對分子量相同(約20.6 kDa)的蛋白帶,與預期的蛋白的相對分子量一致(圖5中的第6～8道)。以山羊抗PPRV陽性血清為一抗,兔抗山羊 HRP-IgG為二抗,Western-blotting分析發(fā)現(xiàn),表達的F1和F2重組蛋白均能與陽性血清發(fā)生反應,提示F1和F2重組蛋白具有良好的反應原性。

圖5 PPRV F1和F2基因的表達及Western-blotting分析Fig.5 Analysis of F1 and F2 recombinant proteins by SDS-PAGE and Western-blotting

2.5 F1和F2蛋白的純化結果

將純化的F1和F2重組蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測,在約20.6 kDa處可見純化的 F1和 F2蛋白條帶(圖6)。

圖6 PPRV F1、F2重組蛋白純化結果Fig.6 Purification of recombinant F1 and F2 protein by Ni-NTA Agarose

3 討論

自從1942年首次報道 PPR以來,全球目前至少已經有29個國家暴發(fā)了該病[1-2,13-15],2007年7月我國西藏自治區(qū)日土縣熱幫鄉(xiāng)龍門卡村山羊首次爆發(fā)PPRV感染,標志著該病已經傳入我國。由于我國過去一直屬于PPR非疫區(qū)國家,因此國內有關PPR的流行病學資料幾乎是空白。同時,與國外相比在 PPR的檢測和監(jiān)測技術研究上也相對滯后[8-12],這給國內PPR流行病學調查與監(jiān)測工作帶來了很大的困難。新疆作為我國最大的以牛羊養(yǎng)殖業(yè)為主的西部邊疆省份,其地貌復雜,獸醫(yī)防疫體系相對較弱,并且與8個國家接壤,邊境線全長5600 km,而與新疆接壤的印度、尼泊爾、巴基斯坦、哈薩克斯坦、塔吉克斯坦等國家都曾大規(guī)模暴發(fā)過PPR疫情,因而 PPR已經嚴重威脅到新疆畜牧業(yè)的安全。因此,嚴密監(jiān)測和防范PPR傳入我國已刻不容緩。

PPRV基因組全長15948核苷酸(Turkey 2000),編碼6種結構蛋白和2種非結構蛋白[5,10],即核蛋白(N)、磷蛋白(P)、多聚酶大蛋白(L)、基質蛋白(M)、融合蛋白(F)和血凝素蛋白(H),其中 F蛋白是PPRV侵染宿主細胞的關鍵蛋白之一[6-7],同時也是誘導機體產生中和抗體的主要保護性抗原,因此克隆和表達F基因對于PPR的免疫預防制劑和診斷試劑的研制具有重要的意義。在本研究中,我們首先對PPRV疫苗株F全長基因進行了克隆和序列分析,然后運用DNAstar軟件對F蛋白的抗原表位進行了分析,發(fā)現(xiàn)F1(第438～911位核苷酸)和 F2區(qū)域(第 921～1390位核苷酸)編碼的抗原表位比較集中,因此將這2個基因片段進一步亞克隆入pET-28a表達載體中進行誘導表達。Western-blotting檢測的結果表明,表達的重組 F1和 F2蛋白均具有良好的反應原性;同時,利用鎳離子柱制備的純度較高的重組F1和F2蛋白,這為進一步研發(fā)特異性強的PPRV診斷試劑奠定了良好的基礎。

[1]Tufan M.Animal health authorities and transboundary animal diseases in Turkey[J].J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health,2006,53(1):35-37.

[2]Kwiatek O,Minet C,Grillet C,et al.Peste des petits ruminants(PPR)outbreak in Tajikistan[J].JComp Pathol,2007,136(3):111-119.

[3]Abraham G,Sintayehu A,Libeau G,et al.Antibody seroprevalences against peste des petits ruminants(PPR)virus in camels,cattle,goats and sheep in Ethiopia[J].Prev Vet Med,2005,70(1/2):51-57.

[4]Osman N A,Ali A S,Rahman M E,et al.Antibody seroprevalences against Peste des Petits Ruminants(PPR)virus in sheep and goats in Sudan[J].Trop Anim Health Prod,2009,41(7):1449-1453.

[5]Bailey D,Banyard A,Dash P,et al.Full genome sequence of peste des petits ruminants virus,a member of the Morbillivirus genus[J].Virus Research,2005,110:119-124.

[6]Dhar P,Muthuchelvan D,Sanyal A,et al.Sequence analysis of the haemagglutinin and fusion protein genes of peste-des-petits ruminants vaccine virus of Indian origin[J].Virus Genes,2006,32(1):71-78.

[7]Kerur N,Jhala M K,Joshi C G.Genetic characterization of Indian peste des petits ruminants virus(PPRV)by sequencing and phylogenetic analysis of fusion protein and nucleoprotein gene segments[J].Res Vet Sci,2007,26(10):456-463.

[8]Balamurugan V,Singh R P,Saravanan P,et al.Development of an indirect ELISA for the detection of antibodies against peste-des-petits-ruminants virus in small ruminants[J].Vet Res Commun,2007,31(3):355-364.

[9]George A,Dhar P,Sreenivasa B P,et al.The M and N genes-based simplex and multiplex PCRs are better than the F or H gene-based simplex PCR for Peste-des-petits-ruminants virus[J].Acta Virol,2006,50(4):217-222.

[10]Muthuchelvan D,Sanyal A,Balamurugan V,et al.Sequence analysis of the nucleoprotein gene of Asian lineage peste des petits ruminants vaccine virus[J].Vet Res Commun,2006,30(8):957-963.

[11]Couacy Hymann E,Bodjo S C,Danho T,et al.Early detection of viral excretion from experimentally infected goats with peste-des-petits ruminants virus[J].Prev Vet Med,2007,78(1):85-88.

[12]Sreenivasa B P,Singh R P,Mondal B,et al.Marmoset B95a cells:a sensitive system for cultivation of Peste des petits ruminants(PPR)virus[J].Vet Res Commun,2006,30(1):103-108.

[13]Yesilbaˇg K,Yilmaz Z,G?lcüE,et al.Peste des petits ruminants outbreak in western Turkey[J].Veterinary Record,2005,157(9):260-261.

[14]Abraham G,Sintayehu A,Libeau G,et al.Antibody seroprevalences against peste des petits ruminants(PPR)virus in camels,cattle,goats and sheep in Ethiopia[J].Prev Vet Med,2005,70(1/2):51-57.

[15]Fr?lich K,Hamblin C,Jung S,et al.Serologic surveillance for selected viral agents in captive and free-ranging populations of Arabian oryx (Oryx leucoryx)from Saudi Arabia and the United Arab Emirates[J].J Wildl Dis,2005,41(1):67-79.

Cloning,Sequence Analysis and Expression of Fusion Gene
ofPeste des petits ruminantsVirus

NI Wei1,CAI Xuepeng2,QIAO Jun1,MENG Qingling1,CHEN Chuangfu1,REN Yan1
(1 The Key Lab of Preventive Veterinary Science,College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2 State Key Lab of Veterinary Etiological Biology,Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Science,Lanzhou 730046,China)

According to fusion(F)protein gene sequence ofPeste des petits ruminantsvirus strain reported by GenBank,a pair of specific primers was designed and used to amplify F gene of PPRV vaccinal strain.The RT-PCR product was purified and ligatured with p GEM-T for sequencing.The open reading frame length of F gene of PPRV strain was 1641 bp,which encoded 546 amino acids.The front 18 amino acids constitute signal peptide,and 488-510 amino acids form transmembrane.Then F1 and F2 genes were subcloned into pET-28a(+)to generate prokaryotic expression vector pETF1 and pETF2,respectively.The recombinant vectors were then transformed intoE.coliBL21(DE3)for expression under induction of IPTG.SDS-PAGE and Westernblotting showed that F1 and F2 recombinant proteins were successfully expressed and of better reactiongenicity recombinant protein F1 and F2 were successfully purified by the kit of Ni-NTA respectively.The experiment laid a foundation for studying the specific diagnosis kit to detect PPRV infection.

Peste des petits ruminantsvirus;F gene;sequence analysis;prokaryotic expression

S858.2 < class="emphasis_bold">文獻標識碼:A

A

2010-07-21

家畜疫病病原生物學國家重點實驗室開放課題(KEYLAB200802)

倪偉(1982-),女,博士研究生,專業(yè)方向為病原分子生物學。

喬軍(1971-),副教授,博士,從事分子病毒學研究;e-mail:qj710625@yahoo.com.cn。