王顏顏,托乎提·阿及德,肖海霞,王金富

(1石河子大學動物科技學院,石河子832003;2新疆畜牧科學院畜牧研究所,烏魯木齊830000)

新疆良種驢DGAT2基因第3內(nèi)含子PCR-SSCP多態(tài)性與體尺性狀的相關(guān)性分析

王顏顏1,托乎提·阿及德2,肖海霞2,王金富1

(1石河子大學動物科技學院,石河子832003;2新疆畜牧科學院畜牧研究所,烏魯木齊830000)

應(yīng)用PCR-SSCP技術(shù)對新疆和田和喀什良種驢群體的DGAT2基因內(nèi)含子3進行單核苷酸多態(tài)性檢測和分析,探討DGAT2基因作為候選基因影響新疆良種驢體尺性狀的可能性。結(jié)果表明:DGAT2基因存在多態(tài)性,其第3內(nèi)含子有兩種等位基因A和B,存在AA和AB兩種基因型,沒有檢測到BB基因型,其中AA基因型為優(yōu)勢基因型。AB型與AA型相比存在堿基發(fā)生A→G的突變,使賴氨酸突變?yōu)榫彼?。新疆和田良種驢AA與AB基因型個體相比,體高和胸圍差異極顯著(P＜0.01),體長差異顯著(P＜0.05),AB型體高、胸圍和體長高于AA型。新疆喀什良種驢AA與AB基因型個體相比,體高差異顯著(P＜0.05),AB型的體高、胸圍和體長高于AA型。新疆喀什良種驢的體高、體長和胸圍高于和田良種驢,差異極顯著(P＜0.01)。

新疆良種驢;DGAT2基因;內(nèi)含子3;PCR-SSCP;多態(tài)性

新疆是我國養(yǎng)驢主產(chǎn)區(qū)之一,主要分布在天山以南喀什、和田、庫車、吐魯番地區(qū)。新疆驢屬于小型驢種,起源于亞洲野驢,經(jīng)長期人工馴化而成[1]。新疆驢是優(yōu)良的地方品種,具有適應(yīng)性強、耐粗飼、生長快等優(yōu)良特性,被列入國家重點畜種保護范圍。為加快新疆驢新品種培育,早在20世紀50-90年代從內(nèi)地引進關(guān)中驢和德州驢,進行雜交選育出一批優(yōu)良的群體,稱為新疆良種驢,為新疆養(yǎng)驢業(yè)的可持續(xù)發(fā)展奠定了堅實的基礎(chǔ)[2]。

二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(diacylgycerol acyltransferase 2,DGAT2)是一種甘油酰基轉(zhuǎn)移酶,是脂肪代謝中重要的酶之一,其與脂類在脂肪細胞中的沉積、血漿中甘油三酯的調(diào)節(jié)、肌肉中能量代謝以及畜禽卵母細胞的形成等有密切的關(guān)系[3-4]。目前,對于DGAT2基因的研究較多的畜禽主要是牛、羊、鵝,主要對畜禽的體尺、肉質(zhì)和產(chǎn)奶性狀影響進行了研究。徐秀蓉等[5]對魯西牛、晉南牛、三河牛、秦川牛和利木贊×魯西牛雜交后代幾個群體為研究材料,利用PCR-RFLP對DGAT2基因內(nèi)含子6和內(nèi)含子7的多態(tài)性與生產(chǎn)性狀的相關(guān)性進行分析,顯示該基因與牛生產(chǎn)性狀相關(guān)。房興堂等[6]研究徐淮白山羊DGAT2基因內(nèi)含子3多態(tài)性,分析結(jié)果顯示,DGAT2基因?qū)ζ潴w高有顯著性的影響(P＜0.05)。

PCR-SSCP是近年來發(fā)展起來的分析基因突變的一項重要技術(shù)。該技術(shù)原理是將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)變性后,進行非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳,由于分子構(gòu)象不同的單鏈DNA會因其遷移率不同而得到分離,根據(jù)條帶位置變化來判斷目的片段是否存在突變[7]。

本試驗利用 PCR-SSCP技術(shù)對新疆和田和喀什良種驢的DGAT2內(nèi)含子3序列片段進行檢測,并對不同SSCP帶型的DNA片段進行測序,分析其多態(tài)性與新疆良種驢的生產(chǎn)性狀的相關(guān)性,以期為提高新疆良種驢的產(chǎn)肉性能,開發(fā)和利用新疆驢資源提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

喀什良種成年驢54頭,血樣采自新疆喀什地區(qū)岳普湖縣中心產(chǎn)區(qū)(♂:關(guān)中驢,♀:新疆驢);和田良種成年驢58頭,血樣采自新疆和田地區(qū)策勒縣中心產(chǎn)區(qū)(♂:德州驢,♀:新疆驢)。

所采個體健康,無親緣關(guān)系。每頭良種驢由頸靜脈采血20 mL,ACD抗凝,血液與抗凝劑充分混勻后,于-20℃冰箱中冷凍保存。

1.1.2 主要試劑與藥品

Taq酶、dNTPs和Marker I均購自東盛生物工程有限公司。Tris堿、EDTA、瓊脂糖、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺均購自美國Sigma公司。溴酚藍、無水乙醇、冰醋酸、硝酸銀、氫氧化鈉、37%甲醛等藥品為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 儀器設(shè)備

PxE型 PCR儀:美國 Thermo Hybaid公司;Protean II XI Cell型垂直電泳槽:美國Bio-Rad公司;水平電泳儀:美國Bio-Rad公司;ImageMaster VDS型凝膠自動成像儀:美國Amersham Pharmaci Biotech公司。

1.1.4 PCR引物合成

根據(jù) GenBank中發(fā)表的人(登錄號:NT_033927.7)、小鼠(登錄號:NT_039433.7)、大鼠(登錄號:NW_047561.1)及牛DGA T2基因的DNA序列(登錄號:NM_205793.2),比較牛與人、小鼠和大鼠的序列同源性分別為91%,89%和90%。目前關(guān)于家驢DGAT2基因研究尚DGAT2基因的結(jié)構(gòu)(外顯子與內(nèi)含子),尚未見有研究報道。本實驗根據(jù)牛的DGAT2基因序列,利用DNAMAN軟件設(shè)計引物。擴增引物的序列如下:

上游引物:5′-CATTGCCGTGCTCTACTTCACCT-3′;

下游引物 :5′-A GTCTCGAAAGTA GCGCCACAA-3′。

1.2 方法

1.2.1 體尺測定

體尺測定參照文獻[8]中的方法。

1)體高:從鬐甲頂點到地面的垂直距離;

2)體長:從肩端到臀端的斜線距離;

3)胸圍:在鬐甲稍后方,用卷尺繞胸1周的長度。

1.2.2 基因組DNA的提取

驢血液基因組DNA的提取采用酚-氯仿抽提法[9]。

1.2.3 PCR擴增體系及參數(shù)

DGAT2基因內(nèi)含子3 PCR擴增體系為:總體積15.0μL;HSTMTaq Mix Kit 6.0μL;Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)0.2μL;上游引物(10 pmol/mL)0.4μL;下游引物(10 pmol/mL)0.4μL;基因組DNA 1.0μL;ddH2O 7.0μL。

反應(yīng)條件:95℃預變性,5 min;94℃變性,30 s;65℃退火,30 s;72℃延伸,30 s;34個循環(huán),72℃,10 min,4℃保存。

1.2.4 SSCP分析

12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠的制備條件:總體積30.0 mL;30%聚丙烯酰胺(29∶1)12.0 mL;5×TBE緩沖液6.0 mL;加ddH2O 12.0 mL;10%過硫酸銨0.21 mL;TEMED 0.025 mL。

取1μL PCR產(chǎn)物,加甲酰胺上樣緩沖液2μL,98℃變性10 min后立即置冰浴保存10 min以上。將變性樣品點于12%PAGE中,300 V電泳5 min后,再150 V恒壓電泳30 h。電泳結(jié)束后,取凝膠于固定液中,固定約15 min,雙蒸水洗2～3次,將凝膠置于銀染液中,輕搖約20 min,雙蒸水洗凝膠2～3次,倒入顯色液輕搖至條帶清晰出現(xiàn),用雙蒸水沖洗干凈以終止反應(yīng)。用凝膠成像儀拍照保存結(jié)果。

1.2.5 PCR產(chǎn)物測序

根據(jù)PCR-SSCP的分型結(jié)果,選擇不同SSCP帶型的PCR擴增產(chǎn)物進行回收純化,由北京六合華大基因科技股份有限公司進行雙向測序。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

統(tǒng)計基因型頻率和基因頻率[10];利用 SPSS 17.0軟件進行方差分析,分析DGAT2基因位點的不同基因型與良種驢體尺性狀的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物檢測

對喀什與和田良種驢的血液基因組DNA的進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,樣品基因組DNA無降解,沒有蛋白質(zhì)、RNA等雜質(zhì)。DNA樣品濃度檢測結(jié)果:OD260/OD280的比值均為1.76～1.82,OD260/OD230的比值均為2.21～2.35,說明提取的DNA符合實驗要求。DGAT2基因內(nèi)含子3的 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果,如圖1所示,可觀察到1條清晰的亮帶,初步判斷 PCR擴增產(chǎn)物在預期的分子量范圍之內(nèi),表明擴增產(chǎn)物可用于遺傳多態(tài)性的檢測。

圖1 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.1 The result of detecting of PCR products of DGAT2 intron 3 by 1.5%agarose gel

2.2 PCR-SSCP結(jié)果與分析

采用SSCP分析DGAT2基因第3內(nèi)含子的多態(tài)性,12%聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果見圖2。由圖2可以看出,該位點存在遺傳多態(tài)性,有兩種等位基因命名為A和B,存在AA和AB兩種基因型,沒有檢測到BB基因型,其中AA基因型為優(yōu)勢基因型。純合子AA型有兩條帶,雜合子AB型有四條帶。

圖2 DGAT基因內(nèi)含子3擴增產(chǎn)物的SSCP分析Fig.2 SSCP analysis of DGAT2 intron 3

2.3 DGAT2基因內(nèi)含子3的測序與分析

對DGAT2基因內(nèi)含子3的兩種基因型片段進行了回收和測序。測序結(jié)果表明:AB型與AA型相比第216位堿基發(fā)生A→G的突變,導致氨基酸編碼改變,使賴氨酸突變?yōu)榫彼?。以下為AA和AB基因型序列比較結(jié)果:

2.4 DGAT2基因內(nèi)含子3 PCR-SSCP多態(tài)性與良種驢體尺性狀的相關(guān)性分析

2.4.1 基因型和等位基因頻率及頻率分布

結(jié)果表明(表1):在檢測的2個群體中,基因型以純合型AA型為優(yōu)勢基因型,基因型頻率AA＞AB。AA和AB基因型頻率在和田和喀什良種驢的基因型頻率分別為:0.7069(0.2931)和0.6852(0.3148)。χ2檢驗結(jié)果表明,在2個群體中基因型頻率和等位基因頻率均差異極顯著(P＜0.01)。2個群體之間比較,基因型頻率和等位基因頻率差異均不顯著(P＞0.05)。2WH群體在該基因座沒有處于 Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P＜0.01)。

表1 DGAT2基因內(nèi)含子3PCR-SSCP基因型和等位基因頻率(n=112)Tab.3 Genotype and allele frequencies of DGAT2 intron 3 by PCR-SSCP

2.4.2 不同基因型與體尺性狀的相關(guān)性分析

和田和喀什良種驢的DGAT2基因內(nèi)含子3的不同基因型與體高、胸圍和體長的關(guān)系見表2。單因素方差分析結(jié)果(表2)表明:和田良種驢AA與AB基因型個體相比,AB型體高(P＜0.01)、胸圍(P＞0.05)和體長(P＜0.01)均高于AA型。喀什良種驢AA與AB基因型個體相比,體高差異顯著(P＜0.05),AB型體高、胸圍和體長均高于AA型,但體長和胸圍差異不顯著(P＞0.05)。實驗群體中喀什良種驢體高、體長和胸圍高于和田良種驢,差異極顯著(P＜0.01)。

表2 不同基因型與體尺性狀的關(guān)系(n=112)Tab.2 Relation between different genotype and body measurement

3 討論與結(jié)論

本實驗檢測了58頭和田良種驢和54頭喀什良種驢,純合基因型AA型為優(yōu)勢基因型,AA基因型頻率最高,雜合基因型AB型的基因型頻率較低,但未檢測到另一種純合基因型BB型的個體,和田良種驢、喀什良種驢的基因型頻率分別為 0.7069(0.2931)和0.6852(0.3148)。這與房興堂等[6]、毛海霞等[11]、張爭鋒[12]的實驗結(jié)果類似。房興堂等[6]研究了徐淮白山羊DGAT2基因內(nèi)含子3多態(tài)性,得到AA與AB兩種基因型,其AA與AB基因型頻率為0.9550(0.0450)。毛海霞等[11]對92頭郟縣紅牛的DGAT2基因進行多態(tài)性分析,顯出AA、AB兩種不同基因型,AA與AB基因型頻率為0.826(0.174)。張爭鋒[12]研究了南陽牛DGAT2基因內(nèi)含子6檢測到 Taq I多態(tài)性,有AA、AB兩種不同基因型,AA與AB基因型頻率為0.75(0.25)。

有報道指出與脂肪吸收、合成和沉積相關(guān)酶的基因可以作為研究奶牛和肉牛部分性狀QTL的候選基因,其多態(tài)性可能和奶牛乳脂率以及肉牛體脂等性狀相關(guān),因此DGAT1和DGAT2基因都可以作為奶牛生產(chǎn)性狀的候選基因[13]。同時有研究表明,DGAT2基因與動物的體重、體尺等指標有關(guān)。Perez等[14]將豬DGAT1基因定位于SSC4p15,在這一區(qū)域內(nèi)存在可能影響豬生長速度、肌肉脂肪含量和脂肪酸組成的QTL。余剛等[15]在研究陜北白絨山羊DGAT1基因時發(fā)現(xiàn)該基因可以作為生長及胴體性狀的候選基因,DGAT1基因AA型與BB型之間、AB型與BB型之間,陜北白絨山羊的斷奶重、周歲重、胸圍和管圍4個性狀差異極顯著(P＜0.01),因此DGAT1基因可以作為陜北白絨山羊肉用性能的分子標記。新疆良種驢DGAT2基因多態(tài)性與體尺性狀的分析結(jié)果表明,良種驢AA與AB基因型個體相比,AB型體高、胸圍和體長均高于AA型。

本研究結(jié)果表明,DGA T2基因內(nèi)含子3AB型與AA型相比第216位堿基發(fā)生A→G的突變,該堿基突變導致 TAG的合成量降低,進而可能引起脂肪合成和蛋白合成量變化,最終導致體高、胸圍和體長這些體尺性狀的改變。AB基因型對新疆良種驢的部分體尺性狀可能有一定程度的影響,表明AB基因型作為體尺性狀的候選分子遺傳標記具有一定的可行性。為了提高新疆驢整體質(zhì)量和數(shù)量,今后可以利用該基因?qū)ζ渌w尺性狀進一步深入研究,通過新疆引進關(guān)中驢和德州驢廣泛地應(yīng)用人工授精技術(shù)把其優(yōu)良性狀快速地傳遞給后代,最終達到優(yōu)質(zhì)、高效的改良效果。

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PCR-SSCP Polymorphism of Intron 3 of DGAT2 Gene of Fine-Breed Xinjiang Donkeys

WANG Yanyan1,TuohuTiaj2,XIAO Haixia2,WANGJinfu1
(1 College of Animal Science&Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2 Research Institute for Animal Science Academy of Xinjiang,Urumqi 830000,China)

PCR-SSCP method was applied to determine and analyse single nucleotide polymorphism of intron 3 of DGAT2 gene of fine breed the Hotan and Kashgar donkey in Xinjiang,the possibility of DGAT2 gene was studied as candidate gene of body measurement and slaughter quality.The results showed that amplifiedfragments existed polymorphism,DGAT2 gene intron had two alleles,A and B,two genotyping AA and AB,but BB was not found,AA is the dominant genotype,the Genotype frequency of which is 0.6964(0.3036).A→G mutation existed in AB,and changed the data encoding.Compared AA genotype with the AB of Hotan donkeys,the body height and chest circumference were very significantly different(P＜0.01),body length significantly different(P＜0.05).AA genotype compared with the AB of Kashgar donkeys,body height significantly different(P＜0.05),body height,chest circumference and body length AB-type were higher than AA.Body height,body length and chest circumference of Kashgar donkeys were higher than Hotan donkeys in experimental groups,the difference was significant(P＜0.01).

fine-breed Xinjiang donkeys;DGAT2 gene;inrton 3;PCR-SSCP;polymorphism

S813.9 < class="emphasis_bold">文獻標識碼:A

A

2010-03-18

新疆維吾爾自治區(qū)科技攻關(guān)項目(200731103)

王顏顏(1983-),女,碩士生,研究方向為動物生理與生物化學;e-mail:wyyzxg090909@sina.com。

托乎提·阿及德(1965-),男,維吾爾族,研究員,從事動物遺傳育種研究。