周向東，陳惠濱，詹舒越，王曉萍* ，歐惠超，羅昭鋒

(1.浙江大學(xué)現(xiàn)代光學(xué)儀器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310027；2.集美大學(xué)信息工程學(xué)院，福建 廈門 361021；3.中國(guó)科技大學(xué)合肥微尺度國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，合肥 230027)

由于環(huán)境污染導(dǎo)致的海水富營(yíng)養(yǎng)化以及赤潮，會(huì)破壞海洋的正常生態(tài)結(jié)構(gòu)。赤潮導(dǎo)致海洋生物死亡產(chǎn)生毒素，并污染海洋中養(yǎng)殖的蝦、貝類等，通過(guò)食物鏈的傳遞，造成人類食物中毒［1］。

目前海洋赤潮毒素的檢測(cè)方法主要有生物分析法、化學(xué)儀器分析法和免疫檢測(cè)法。以小鼠實(shí)驗(yàn)為典型的生物分析法［2］，雖然簡(jiǎn)單易行，但因生物個(gè)體差異，導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果偏差大，且靈敏度非常低，特異性差。高效液相色譜法［3－4］可以準(zhǔn)確分離各種組分，實(shí)現(xiàn)海洋藻毒素定性和定量分析，但是大多數(shù)毒素如PSP(Paralytic Shellfish Poisoning，)、DSP(Diarrhetic Shellfish Poisoning，腹瀉性貝類毒素)等必須經(jīng)熒光衍生后才能檢測(cè)，衍生后的熒光產(chǎn)物均很不穩(wěn)定，容易造成測(cè)量偏差。因此國(guó)內(nèi)外逐步將色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)［5］應(yīng)用于多種海洋生物毒素的分析，但色譜分析法因?yàn)閮x器昂貴，需要專業(yè)操作人員等原因限制了方法的普及和應(yīng)用。利用多克隆或單克隆抗體檢測(cè)的酶聯(lián)免疫分析法［6－8］具有高特異性和選擇性，分析過(guò)程無(wú)需繁瑣的樣品前處理步驟，具有商品化的試劑盒為該方法的進(jìn)一步廣泛應(yīng)用提供了可能性。但其檢測(cè)過(guò)程需要酶標(biāo)記抗體及依賴于酶催化反應(yīng)的比色檢測(cè)，導(dǎo)致成本增加，耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)，且檢測(cè)過(guò)程仍需依賴實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，難以適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)分析檢測(cè)的實(shí)時(shí)性要求。

本文以在我國(guó)渤海、長(zhǎng)江口、福建沿海、珠江口、香港和臺(tái)灣等海域廣泛分布［9］的腹瀉性貝類毒素中的大田軟海綿酸(Okadaic Acid，OA)為分析檢測(cè)對(duì)象，將免疫分析方法與表面等離子共振檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，建立一種免標(biāo)記、響應(yīng)速度快、靈敏度高、低成本的可以應(yīng)用于海洋赤潮毒素分析的快速SPR免疫檢測(cè)分析方法。提出并設(shè)計(jì)了一種小型化、可適用于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的SPR免疫檢測(cè)分析系統(tǒng)，制備了可識(shí)別OA的特異性免疫傳感芯片，通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析并評(píng)價(jià)了該檢測(cè)系統(tǒng)的性能指標(biāo)。

1 檢測(cè)原理與實(shí)驗(yàn)裝置

表面等離子共振是光在玻璃與金屬薄膜界面發(fā)生全反射時(shí)產(chǎn)生的倏逝波引發(fā)金屬表面的自由電子產(chǎn)生表面等離子(Surface Plasmon，SP)，并在表面等離子與倏逝波頻率和波數(shù)相同的情況下產(chǎn)生的一種共振現(xiàn)象，由此導(dǎo)致反射光的能量急劇下降，反射光譜上出現(xiàn)共振峰。當(dāng)傳感芯片表面固定一層生物分子識(shí)別膜，將待測(cè)樣品流過(guò)芯片表面，若樣品中有能夠與芯片表面的生物分子相互作用的分子，會(huì)引起金膜表面折射率變化，最終導(dǎo)致SPR共振峰變化，從而可獲得被分析物的濃度、親和力、動(dòng)力學(xué)常數(shù)和特異性等信息［10］。

自行研制開發(fā)的表面等離子共振免疫檢測(cè)分析系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1所示。傳感器選用Kretschmann結(jié)構(gòu)的TSPR1A170100 SpreetaTM傳感器，其折射率分辨率為5×10－6RIU，具有體積小、功耗低、性價(jià)比高等特點(diǎn)；十通閥(美國(guó)Valco Inc.)用于切換選擇緩沖液、待檢樣品和再生液等；工業(yè)注射泵(Sapphire EngineeringTMInc.)依據(jù)程序?qū)⒏鞣N溶液注射流經(jīng)表面功能化的SPR傳感器表面，傳感器輸出的SPR光譜經(jīng)信號(hào)檢測(cè)與控制電路采集后，傳送到計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析處理。在軟件的控制下，系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)進(jìn)樣、測(cè)量、再生、清洗等功能。

2 材料與方法

2.1 材料

NHS(N－h(huán)ydroxysuccinimide，N－羥基琥珀酰亞胺)；EDC(1－ethyl－3－(3－dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，水溶性碳化二亞胺)；TeCP(tetrachlophenoxide，四氯苯酚)；鹽酸乙醇胺(1 mol/L ethanolamine hydrochloride，pH=8.5，Alfa Aesar Inc.):純度＞98%；SDS(sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉)溶液:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%；OA-mAb(OA單克隆抗體，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)；OA標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma Inc.):純度＞95%；OA-BSA(OA牛血清蛋白偶聯(lián)物溶液，Sigma Inc.)；PBS(phosphate buffered saline，磷酸鹽緩沖液):將8.0 g NaCl、2.9 g Na2HPO4、0.2 g KH2PO4、0.2 g KCl溶于800 mL蒸餾水中，調(diào)整溶液pH值至7.4，補(bǔ)充液體使溶液體積為1 L，分裝、高壓蒸汽滅菌后室溫保存；再生液:100 mmol/L的NaOH溶液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的SDS溶液混合。

2.2 測(cè)試方法及生物芯片制備

由于OA是小分子，為提高檢測(cè)靈敏度通常采用間接檢測(cè)法即抑制法進(jìn)行測(cè)量。其過(guò)程為:將OA抗原偶聯(lián)在SPR傳感器芯片(金膜)表面；將適量的OA-mAb與含有OA分子的被測(cè)溶液混合，抗原抗體結(jié)合達(dá)到平衡態(tài)，此時(shí)混合液有一定量多余的OA-mAb；將該混合液作為SPR儀器的被測(cè)樣品注入并流經(jīng)傳感器金膜表面，此時(shí)混合液中多余的OA-mAb與修飾在傳感器金膜表面的OA抗原結(jié)合，SPR輸出信號(hào)發(fā)生變化，根據(jù)SPR輸出信號(hào)的大小，可以得到混合液中多余OA-mAb的量，從而可以計(jì)算出被測(cè)溶液中的OA分子濃度。

為使SPR傳感器對(duì)特定待測(cè)分子具有特異性，需要對(duì)傳感器芯片(金膜)表面進(jìn)行修飾。對(duì)于OA傳感芯片的制備，是利用OA-BSA偶聯(lián)物的巰基與傳感器金膜表面共價(jià)偶聯(lián)，形成一層自組裝的單分子檢測(cè)層。具體的步驟如下:

①用H2SO4∶H2O2(98%濃硫酸∶30%雙氧水=7∶3)清洗傳感器金膜表面12 h。

②取OA-BSA溶液20 μL滴于芯片表面反應(yīng)8 h，使OA-BSA通過(guò)巰基固定于芯片表面。

③回收芯片表面的OA-BSA溶液，沖洗芯片表面，氮?dú)獯蹈桑? mg/mL BSA+1%TeCP 溶液 20 μL滴于芯片表面，反應(yīng)5 h。在TeCP作用下，BSA的蛋白二硫鍵被打開，封閉未吸附OA-BSA的金膜表面，以減少結(jié)合過(guò)程的非特異性吸附。

④沖洗芯片表面，氮?dú)獯蹈?。NHS/EDC混合溶液20 μL滴于芯片表面反應(yīng)5 h，交聯(lián)活化芯片，使得芯片表面的獨(dú)立蛋白BSA之間的羧基與氨基交聯(lián)在一起，提高結(jié)合的穩(wěn)定性。

⑤沖洗芯片表面，氮?dú)獯蹈?。鹽酸乙醇胺20 μL滴于芯片表面反應(yīng)12 h，封閉芯片表面多余的羧基，減少羧基對(duì)抗體蛋白的非特異性吸附。

2.3 測(cè)試過(guò)程

2.3.1 測(cè)試條件優(yōu)化

分別以100 mmol/L NaOH與100 mmol/L NaOH+0.05%SDS混合溶液為再生液，以稀釋200倍的OA-mAb溶液作為檢測(cè)樣品，25 μL/min速度進(jìn)樣，進(jìn)樣量50 μL，考察芯片再生后，基線的恢復(fù)能力。

將OA 單克隆抗體用 PBS 按 1 ∶100、1 ∶200、1∶300比例稀釋后，分別作為檢測(cè)樣品，以25 μL/min速度進(jìn)樣，進(jìn)樣量50 μL，測(cè)試三種不同稀釋比抗體溶液的SPR響應(yīng)值，選擇合理的稀釋倍數(shù)。

2.3.2 檢測(cè)方法性能測(cè)試

以 1 ∶200 OA-mAb 溶液為測(cè)試樣品，25 μL/min速度進(jìn)樣，每次進(jìn)樣50 μL并再生，連續(xù)進(jìn)樣12次，測(cè)試芯片穩(wěn)定性。

用PBS緩沖液、OA標(biāo)準(zhǔn)品和1∶200 OA-mAb溶液，配制出 OA 含量分別為 2.5、5、10、20、40、80、160、320、640、1280 ng/mL OA 的混合溶液，由高濃度到低濃度依次檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)3次，獲取OA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 結(jié)果與討論

3.1 測(cè)試條件選定

抗體稀釋200倍，兩種不同再生液條件下的SPR譜圖如圖 2、圖 3所示，分別以 100 mmol/L NaOH、100 mmol/L NaOH+0.05%SDS 混合溶液為再生液，SPR結(jié)合前與恢復(fù)后的基線并不對(duì)齊，存在大約48RU、77RU的結(jié)合量差值，表明所選擇的再生液并不能使傳感器表面的抗原和抗體結(jié)合物完全分離。而由100 mmol/L NaOH+0.05%SDS混合溶液、100 mmol/L NaOH兩種再生溶液先后再生兩次可以使基線回復(fù)到起始水平，如圖1所示，因此設(shè)定再生條件先由100 mmol/L NaOH+0.05%SDS混合溶液再生，后由100 mmol/L NaOH再次再生一次。

圖2 抗體稀釋200倍，再生液為NaOH的SPR譜圖

圖3 抗體稀釋200倍，再生液為NaOH+SDS的SPR譜圖

OA-mAb稀釋100、200、300倍的SPR譜圖如圖4所示，由圖可見，在相同的進(jìn)樣速度和進(jìn)樣量條件下，抗體稀釋100倍的溶液結(jié)合量最大，達(dá)135RU；而抗體稀釋300倍的溶液結(jié)合量最小，僅為80RU。雖然抗體稀釋100倍溶液結(jié)合值較大，但抑制濃度隨之增大，最終導(dǎo)致檢測(cè)限變大，且抗體消耗量也大，會(huì)增加分析成本；而抗體稀釋300倍的溶液結(jié)合值低，競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍小，會(huì)導(dǎo)致定量濃度范圍變窄。因此選擇抗體稀釋200倍較為恰當(dāng)，其響應(yīng)值為123RU，能在檢測(cè)限、樣品消耗量及信號(hào)動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍之間取得一個(gè)合理的平衡。

圖4 單次完整的測(cè)量過(guò)程，

3.2 穩(wěn)定性

分析重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的12次測(cè)量結(jié)果，求得12次響應(yīng)信號(hào)的均值約為123.6RU，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.34RU，RSD值為1.51%，響應(yīng)信號(hào)的最大偏差在8RU之內(nèi)。結(jié)果表明傳感器芯片表面偶聯(lián)的抗原結(jié)合牢固，抗體稀釋倍數(shù)和再生條件選擇合理。在該條件下，測(cè)試方法具有良好的重復(fù)性。

3.3 抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線

分析不同濃度OA溶液的SPR測(cè)量結(jié)果，以SPR傳感器的響應(yīng)結(jié)合值為縱坐標(biāo)，OA濃度值的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，得到OA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。結(jié)合值最低和最高濃度端分別由于飽和結(jié)合及抑制溶液中抗體濃度低而趨向于平穩(wěn)，中間部分呈線性遞減的過(guò)程，很好的符合抑制模式的抗原抗體生物測(cè)量過(guò)程。用Sigmoidal非線性關(guān)系擬合，得方程Y=A2+(A1－A2)/(1+(x/x0)p)，A1=113.0，A2=33.3，x0=182.7，p=2.4，擬合曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.993。

圖5 OA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

FDA的《標(biāo)準(zhǔn)分析方法與步驟依據(jù)指南》［11］中定義的檢測(cè)限為DL=3.3σ/S，其中σ為重復(fù)性測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。由標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量點(diǎn)可得S=0.398RU·mL/ng，σ=2.34RU，進(jìn)而可以計(jì)算出該方法的檢測(cè)限為19.4 ng/mL，半抑制濃度 IC50(Half-maximal Inhibitory Concentration)為177 ng/mL。由標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)限可確定其定量范圍為40 ng/mL～640 ng/mL。

由圖4可知，一次完整的SPR檢測(cè)過(guò)程包括結(jié)合、解離、再生及恢復(fù)四個(gè)過(guò)程，耗時(shí)約為15 min左右。在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程種，根據(jù)單次測(cè)量的響應(yīng)值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到相應(yīng)的OA濃度值。相比化學(xué)儀器分析法及酶聯(lián)免疫法，其快速定量過(guò)程是一大優(yōu)勢(shì)，可滿足現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)的需求。

4 結(jié)論與展望

本文結(jié)合表面等離子共振技術(shù)與免疫檢測(cè)技術(shù)，以大田軟海綿酸為例，以點(diǎn)帶面，研究和建立了一種新型赤潮毒素的檢測(cè)方法。并基于所設(shè)計(jì)的表面等離子免疫檢測(cè)分析系統(tǒng)，分析評(píng)價(jià)了該方法的主要性能指標(biāo)。研究表明，所建立的檢測(cè)方法，可以滿足國(guó)際上對(duì)于海水赤潮災(zāi)害毒素警戒標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)要求。所采用免疫檢測(cè)技術(shù)具有特異性，可直接分析海水中OA，省去了大量繁瑣的樣品前處理過(guò)程，縮短了樣品分析時(shí)間(單次樣品的分析時(shí)間僅為15 min)；所設(shè)計(jì)的傳感器經(jīng)再生后可重復(fù)使用上百次，且無(wú)需任何標(biāo)記即可實(shí)現(xiàn)OA實(shí)時(shí)檢測(cè)，從而大大節(jié)省分析測(cè)試的成本。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)OA檢測(cè)的檢測(cè)限未能明顯優(yōu)于其他的檢測(cè)方法。但通過(guò)樣品富集［12］或抗體信號(hào)增強(qiáng)［13］等方法可以大大改善系統(tǒng)的檢測(cè)限，且所研究建立的新方法很好地克服了傳統(tǒng)分析方法操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，成本高或需要標(biāo)記等不足。因此，本文建立的新方法為海水水質(zhì)的在線分析檢測(cè)提供了新的選擇方案。

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