黃新莉， 仲維佳， 劉清和， 田慶顯， 周君琳△

(1 河北醫(yī)科大學病理生理教研室， 河北 石家莊 050017； 2 首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院骨科， 北京 100020)

硫化氫對肢體缺血再灌注所致大鼠急性肺損傷的作用及機制*

黃新莉1， 仲維佳2， 劉清和2， 田慶顯2， 周君琳2△

(1河北醫(yī)科大學病理生理教研室， 河北 石家莊 050017；2首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院骨科， 北京 100020)

目的探討內(nèi)、外源性硫化氫(H2S)在肢體缺血再灌注(IR)所致大鼠急性肺損傷(ALI)中的作用并初探其機制。方法應用雙大腿根部止血帶復制大鼠雙后肢缺血及再灌注后肺損傷模型。將120只SD大鼠隨機分為對照組(control)、IR組、NaHS+IR組和抑制H2S生成的炔丙基甘氨酸(PPG)+IR組。肢體缺血再灌注后4 h處死動物, 測定肺系數(shù)；光鏡下觀察肺組織形態(tài)學改變；化學法檢測血漿H2S、NO、CO含量，肺組織丙二醛(MDA)含量、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和血紅素加氧酶(HO)活性以及支氣管肺泡灌洗液(BALF)中中性粒細胞(PMN)數(shù)目和蛋白含量變化，并對血漿H2S含量與上述指標進行相關性分析。結(jié)果大鼠肢體IR可引起肺組織明顯的形態(tài)學改變、肺系數(shù)和肺組織MDA含量增加、BALF中PMN數(shù)目和蛋白含量增加、血漿H2S含量和肺組織CSE活性下降、肺組織iNOS活性和HO活性及血漿中NO含量和CO含量增加。預先給予NaHS可顯著減輕IR所致上述指標的改變; 而預先給予PPG可加重IR所致肺損傷, 使BALF中PMN數(shù)目和蛋白含量、血漿NO含量和肺組織iNOS活性進一步增加, 但對血漿CO含量和肺組織HO活性無明顯影響。H2S含量與CSE活性、血漿CO含量、肺組織HO活性呈正相關(均P<0.01);與其它指標呈負相關(均P<0.01)。結(jié)論H2S/CSE體系的下調(diào)參與介導了大鼠肢體IR所致大鼠ALI的發(fā)生, 內(nèi)、外源性H2S具有抗肢體IR所致ALI的作用, 該作用可能與其抗氧化效應、減輕PMN所致肺部過度炎癥反應以及下調(diào)NO/iNOS體系、上調(diào)CO/HO體系有一定關系。

硫化氫； 急性肺損傷； 一氧化氮； 一氧化碳； 胱硫醚γ裂解酶

肢體缺血是臨床常見的病理征象，盡管恢復其血液循環(huán)是挽救肢體所必須的，但是缺血再灌注(ischemia-reperfusion, IR)不僅可能加重局部缺血組織的損傷，嚴重時尚可引起全身炎癥反應綜合征，甚至遠隔的多臟器功能障礙綜合征，其中肺是易受累的首位靶器官，表現(xiàn)為急性肺損傷(acute lung injury, ALI)甚至急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)[1]，病死率極高，但其發(fā)病機制迄今尚未完全闡明。本室研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性氣體信號分子一氧化氮(nitric oxide, NO)和一氧化碳(carbon monoxide, CO)在此種ALI中發(fā)揮重要作用，且二者之間具有交互作用[2-4]。H2S是繼NO和CO之后新近發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號分子[5]，參與神經(jīng)和血管功能調(diào)節(jié)等多種生理和病理過程[6-8]。但H2S在肢體IR所致大鼠ALI中的作用及其機制尚不清楚。本實驗擬檢測ALI時H2S及其生成關鍵酶胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)的變化；并應用H2S供體NaHS和CSE抑制劑炔丙基甘氨酸(propargylglycine, PPG)觀察H2S對ALI時肺組織損傷指標、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中性粒細胞(polymorphonuclear granulocytes，PMN)計數(shù)和蛋白含量以及NO/誘導型NO合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、CO/血紅素加氧酶(hemeoxygenase, HO)體系變化的影響，以探討H2S在肢體IR所致ALI中的作用及可能機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑 NaHS、炔丙基甘氨酸(propargyl-glycine,PPG)、L-半胱氨酸、5’-磷酸吡哆醛、N,N-二甲基-對苯二胺硫酸鹽、血紅蛋白、血紅素、NADP、6-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖脫氫酶均購自Sigma; NO與CO含量、iNOS與HO活性、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、考馬斯亮藍檢測試劑盒購自南京建成生物公司。

1.2動物 清潔級健康雄性SD大鼠120只,體重200-250 g(購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心)，自由攝食、飲水,室溫18-24 ℃，相對濕度40%-70%，每天12 h光照維持,晝夜循環(huán)。

2方法

2.1動物模型 按照Cohen等[9]提供的方法復制肢體IR致ALI動物模型：體重為250-300 g的健康SD雄性大鼠(河北醫(yī)科大學動物試驗中心)，苯巴比妥鈉(40 mg/kg BW，腹腔注射)麻醉。以橡皮止血帶綁扎雙后肢根部造成肢體缺血，4 h后松開止血帶使肢體血流再灌注。應用激光多普勒(PriFlux 5001型，Perimed)探測血流以保證肢體的缺血和再灌注。

2.2實驗分組 實驗大鼠適應性喂養(yǎng)1周后, 按窩別隨機分為4組(n=16)：對照組(control)，IR、NaHS+IR和PPG+IR組。對照組動物給予同樣的麻醉和操作只是不造成肢體缺血。IR組動物使雙后肢缺血4 h后再灌注。對照組和 IR組動物分別于再灌注前10 min和相應的對照時點腹腔注射無菌生理鹽水(0.5 mL)。NaHS+IR和PPG+ IR組動物分別于再灌注前10 min腹腔注射NaHS(28 μmol·kg-1, 溶于0.5 mL生理鹽水)和PPG(45 mg·kg-1, 溶于0.5 mL生理鹽水)。每組各取8只, 于缺血肢體再灌注后4 h行生化和形態(tài)學檢查，另取8只行支氣管肺泡灌洗。

2.3標本制備 實驗結(jié)束時，放血處死動物，留取血漿以檢測H2S、NO和CO含量。取全肺稱重以測定肺系數(shù),留取左側(cè)肺葉下部以10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，經(jīng)HE染色以觀察肺組織形態(tài)學變化；取左側(cè)肺葉中上部，制備肺組織勻漿，用于檢測MDA含量和CSE、iNOS、HO活性。

2.4肺組織中MDA 含量檢測 采用硫代巴比妥酸法，按照試劑盒說明書進行操作。

2.5血漿中H2S 含量測定 采用去蛋白的分光光度法[7]。根據(jù)H2S標準曲線計算H2S的含量。

2.6血漿中CO含量測定 參照Chalmers等[10]的雙波長分光光度法，以血漿中HbCO的百分比含量(%)代表CO含量。

2.7血漿中NO含量測定 采用硝酸還原酶法,按照試劑盒說明書進行操作。

2.8肺系數(shù)測定 自氣管分叉以上5、6軟骨環(huán)間剪斷氣管，用濾紙吸干肺表面血污后稱質(zhì)量。肺系數(shù)=全肺濕質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(kg)。

2.9肺組織CSE活性測定 參照文獻[7]方法。組織中CSE活性以每毫克組織在每分鐘生成H2S的nmol表示。

2.10肺組織iNOS活性測定 采用分光光度法，嚴格按試劑盒說明進行操作。

2.11肺組織HO活性檢測 采用HO降解血紅素生成膽綠素和CO的原理，通過測定樣品反應物中膽紅素生成的量來代表HO活性。取肺組織，加4倍體積磷酸鹽緩沖液(0.1mol·L-1，pH 7.4)制成勻漿，4 ℃、15 000×g離心15 min，取上清-70 ℃保存。反應體系含肺組織勻漿上清液20 μL、血紅素20 μmol·L-1、NADP 0.8 mmol·L-1、肝組織勻漿上清液20 μL(作為膽綠素還原酶的來源)、6-磷酸葡萄糖4 mmol·L-1和6-磷酸葡萄糖脫氫酶1U，反應體積1 mL。37 ℃暗處反應1 h，于冰上終止反應。不含NADP的樣品作空白對照。用分光光度計于464 nm和530 nm處測定吸光度。膽紅素消光系數(shù)40 mmol·L-1·cm-1，計算1 mg HO蛋白1 h催化血紅素降解生成膽紅素的pmol數(shù)，以此表示HO活性。肺組織勻漿上清液蛋白測定采用考馬斯亮藍法。

2.12肺組織形態(tài)學觀察 光鏡下觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。每組選取6張玻片，每張玻片連續(xù)觀察10個視野(×100)，計算損傷肺泡(肺泡內(nèi)含有紅細胞或/和中性粒細胞2個以上)數(shù)占計數(shù)肺泡總數(shù)百分比，即肺泡損傷數(shù)比值，作為肺損傷的組織學定量評價指標(index of quantitative assessment，IQA)。

2.13支氣管肺泡灌洗液蛋白定量和PMN計數(shù) 全肺以4 ℃無菌生理鹽水10 mL進行支氣管肺泡灌洗，分2次進行；第1個5 mL生理鹽水經(jīng)氣管插管緩慢注入動物肺內(nèi)，保留0.5-1 min，同時輕輕按摩胸壁。反復灌洗5次后回收；第2個5 mL僅灌洗1次。將兩次回收的BALF經(jīng)雙層紗布過濾，離心(1 000 r/min,10 min),留取上清用改良酚試劑測定蛋白含量。沉定部分重新懸浮于1 mL生理鹽水中。取部分懸液采用甲紫染色，計數(shù)白細胞總數(shù)；其余部分涂片，姬姆薩-瑞氏染色,光鏡下計數(shù)500個細胞，計算細胞分類比例。BALF中PMN數(shù)量(×109/L)=BALF中血細胞總數(shù)(×109/L)×500個細胞中PMN的比例數(shù)。

3統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1肺組織形態(tài)學改變

光鏡下對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡內(nèi)未見水腫液，肺泡腔內(nèi)可見少量淋巴細胞及單核巨噬細胞。IR組肺組織出現(xiàn)水腫、出血及PMN在肺內(nèi)聚集的病理學變化，IQA與對照組相比明顯增高(均P<0.01)。NaHS+IR組肺組織病變較相應時間點的IR組明顯減輕，大部分肺組織接近正常，局部肺組織少量炎細胞浸潤，肺泡隔略有增寬，IQA亦較相應時間點IR組明顯下降(均P<0.01)。PPG+IR組肺組織損傷較IR組加重, IQA亦升高(P<0.05),見圖1、表1。

Figure 1. Effect of H2S on the lung tissue structure after limb IR in rats (HE,×400).A:control group; B:IR group; C:NaHS+IR group; D:PPG+IR group.

圖1H2S對大鼠肢體IR致肺損傷時肺組織學變化的影響

表1各組大鼠肺系數(shù)、肺組織中MDA含量及IQA的變化

GroupIW/BWMDA(nmol·L-1)IQAControl4.13±0.1236.68±1.8418.79±1.16IR5.34±0.20*60.98±2.22*40.14±1.20*NaHS+IR4.85±0.17*#50.98±2.23*#27.15±1.39*#PPG+IR5.80±0.15*71.29±3.37*43.58±1.52*

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsIR group.

2肺系數(shù)和肺組織中MDA含量的變化

各組大鼠二者的變化趨勢一致， IR組明顯高于對照組(P<0.01)和NaHS+IR組(P<0.05), 低于PPG+IR組(P<0.05),見表1。

3BALF中PMN數(shù)目和蛋白含量的變化

各組大鼠二者的變化趨勢一致，IR組明顯高于對照組(P<0.01)和NaHS+IR組(P<0.05),低于PPG+IR組(P<0.05)，見表2。

表2各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中PMN數(shù)量及蛋白含量的變化

GroupPMNProtein(mg·L-1)Control2.71±0.37131.51±2.00IR7.07±0.69*191.89±3.52*NaHS+IR5.44±0.47*#162.65±4.83*#PPG+IR8.79±0.90*213.46±6.67*

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsIR group.

4血漿H2S含量和肺組織CSE活性的變化

各組大鼠二者的變化趨勢一致，IR組低于對照組(P<0.05)和NaHS+IR組(P<0.05)，高于PPG+IR組(P<0.01)，見表3。

表3各組大鼠血漿中H2S濃度和肺組織中CSE活性的變化

GroupH2S(μmol·L-1)CSE(μmol·g-1·min-1)Control171.26±3.1082.34±1.98IR125.59±3.90*73.87±2.09*NaHS+IR215.63±9.97*#86.50±30.79*#PPG+IR110.29±9.71*61.51±1.82*

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsIR group.

5血漿NO含量及肺組織iNOS活性的變化

IR組血漿NO含量和肺組織中iNOS活性明顯高于對照組(P<0.01)和NaHS+IR組(P<0.01)，低于PPG+IR組(P<0.05)，見表4。

表4各組大鼠血漿中NO濃度及肺組織中iNOS活性的變化

GroupNO(μmol·L-1)iNOS(103U·g-1protein)Control75.89±2.24178.89±3.97IR131.73±2.23*277.94±6.81*NaHS+IR102.15±3.96*#226.87±5.09*#PPG+IR150.06±1.37*#295.57±5.38*#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsIR group.

6血漿CO含量及肺組織HO活性的變化

IR組血漿CO含量和肺組織HO活性明顯高于對照組(P<0.05)；NaHS+IR組二者進一步增高，顯著高于IR組(P<0.01)；PPG+IR組與IR組相比二者無明顯差別(P>0.05)，見表5。

表5各組大鼠血漿中CO含量及肺組織中HO活性的變化

GroupCO(%HbCO)HO(nmol·g-1·h-1)Control0.49±0.0285.55±1.27IR1.01±0.08*108.33±1.19*NaHS+IR1.36±0.09*#118.14±1.52*#PPG+IR0.57±0.04*76.23±5.19*

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsIR group.

7血漿H2S含量的變化與其它各項指標的相關性分析

相關性分析表明，IR組、NaHS+IR組和PPG+IR組大鼠血漿H2S含量的變化與肺組織CSE活性、血漿CO含量、肺組織HO活性呈正相關(r=0.945-0.987，均P<0.01)；與其它指標呈負相關(r=-0.994～-0.943，均P<0.01)。

討 論

內(nèi)源性H2S主要是由含硫氨基酸(L-半胱氨酸)經(jīng)多種酶促反應產(chǎn)生，其限速酶主要包括：胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase, CBS) 和CSE。CBS和CSE的表達具有組織特異性，心、肺組織中內(nèi)源性H2S主要由CSE催化產(chǎn)生。H2S在體內(nèi)以2種形式存在-未溶解的氣體H2S (約占1/3 ) 和HS-鈉鹽NaHS (約占2/3 )。NaHS在體內(nèi)可分解為Na+及HS-，后者與體內(nèi)H+結(jié)合生成H2S，H2S和NaHS在體內(nèi)形成動態(tài)平衡[5]。目前認為，H2S是繼NO和CO之后人們發(fā)現(xiàn)的一種新的內(nèi)源性小氣體信號分子。已有研究表明[11-15]，H2S在許多肺疾病的發(fā)病機制中起著重要的調(diào)控作用，諸如慢性阻塞性肺疾病、肺炎癥性損傷及肺纖維化等。本研究在大鼠肢體IR所致ALI模型上發(fā)現(xiàn)大鼠肢體IR致肺損傷時，血漿H2S含量和肺組織CSE活性下降；為進一步闡明H2S/CSE變化的意義，本研究分別觀察了補充H2S以及進一步抑制H2S對此種肺損傷的作用。結(jié)果顯示，應用H2S供體-NaHS使H2S含量升高可明顯減輕肢體IR所致肺損傷；而應用CSE活性抑制劑-PPG抑制CSE活性從而使H2S產(chǎn)生減少則明顯加重此種肺損傷，結(jié)果提示肢體IR后肺內(nèi)H2S/CSE體系的下調(diào)參與介導了肢體IR后ALI的發(fā)生，內(nèi)源性和外源性H2S具有抑制肢體IR所致肺組織損傷的保護作用。

盡管對于肢體IR所致ALI的發(fā)生機制尚未完全闡明，但目前認為IR引起的PMN肺內(nèi)大量扣押及氧化應激損傷是其發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[1]。本研究通過對肢體IR致ALI時肺組織中氧化產(chǎn)物-MDA含量、BALF中PMN數(shù)目和蛋白含量變化的檢測進一步佐證了此種病理生理變化，同時發(fā)現(xiàn)抑制內(nèi)源性H2S可使肺內(nèi)MDA含量、BALF中PMN數(shù)目和蛋白含量進一步增高，而補充H2S可明顯降低ALI時肺內(nèi)MDA的生成以及BALF中PMN數(shù)目和蛋白含量，提示H2S抗肢體IR所致ALI的保護作用與其抑制PMN肺內(nèi)扣押以及抗氧化作用有關。

NO是最早發(fā)現(xiàn)的氣體信號分子,可參與生理狀態(tài)下和多種肺疾病的發(fā)生。NOS是合成NO的關鍵酶。研究表明[2]，肢體IR致ALI時肺內(nèi) iNOS表達上調(diào)并產(chǎn)生大量NO，后者產(chǎn)生細胞毒性作用從而參與介導了肢體IR后ALI的發(fā)生。CO是繼NO后發(fā)現(xiàn)的第2個雙原子氣體信使分子，內(nèi)源性CO主要由HO催化血紅素降解產(chǎn)生。研究表明[2-4]，肢體IR可使肺內(nèi)誘導型HO(HO-1)表達增多并使CO產(chǎn)生增多，CO/HO-1具有抗炎癥、抗氧化等重要組織保護作用，而且在CO和NO兩個信使系統(tǒng)之間存在相互協(xié)調(diào)、相互制約的關系，目前對氣體信號系統(tǒng)之間交互作用的研究成為新的熱點。本研究通過檢測肺組織中iNOS和HO活性、血漿NO和CO含量的變化及其與H2S含量變化的相關性，發(fā)現(xiàn)肢體IR后肺內(nèi)H2S減少的同時，NO/iNOS和CO/HO-1含量及活性增高；給予PPG抑制內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生，可進一步上調(diào)NO/iNOS體系，該組CO/HO體系與IR組相比無顯著差異，可能因樣品數(shù)較小所致； 給予H2S供體NaHS可下調(diào)NO/iNOS、上調(diào)CO/HO-1；而且H2S含量與血漿NO含量、iNOS活性呈負相關，與CO含量、HO活性呈正相關。由此推測, 大鼠肢體IR致ALI時,3種氣體信號分子間可能存在相互調(diào)節(jié)的關系，而且H2S的保護作用可能與其抑制肢體IR時肺內(nèi)iNOS活性及NO的大量產(chǎn)生、增強HO-1活性以及CO含量有關，具體機制有待進一步研究。

總之, 本實驗結(jié)果表明內(nèi)源性H2S的減少參與了肢體IR所致大鼠ALI的發(fā)生, 而一定量的外源性H2S可通過抗炎、抗氧化作用以及下調(diào)NO/iNOS體系、上調(diào)CO/HO-1體系發(fā)揮一定的抗損傷作用。

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Roleofhydrogensulfideinacutelunginjuryinducedbyischemia-reperfusionofhindlimbsinrats

HUANG Xin-li1, ZHONG Wei-jia2, LIU Qing-he2, TIAN Qing-xian2, ZHOU Jun-lin2

(1DepartmentofPathophysiology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China;2DepartmentofOrthopedics,BeijingChaoyangHospital,CapitalMedicalScienceUniversity,Beijing100020,China.E-mail:junlinzhou@yahoo.cn)

AIM: To explore the role of endogenous and exogenous hydrogen sulfide (H2S) in acute lung injury (ALI) induced by ischmia-reperfusion (IR) of hind limbs in rats.METHODSA Sprague-Dawley rat model of acute lung injury was induced by ischemia of the hind limbs for 4 h and reperfusion for another 4 h. The rats (n=120) were randomly divided into 4 groups: control, IR, NaHS (H2S donor)+IR, and propargylglycine [PPG, inhibitor of cystathionine γ-lyase (CSE)]+IR. The animals were sacrificed after reperfusion. Lung weight/body weight ratio (LW/BW) was measured and calculated. Morphological changes of the lung tissues were observed. The concentrations of H2S, nitric oxide (NO) and carbon monoxide (CO) in plasma were tested. The content of malondialdehyde (MDA), the activity of CSE, inducible nitric oxide synthase (iNOS) and hemeoxygenase (HO) in the lungs were determined. The polymorpho-nuclear neutrophils(PMN) and protein content in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) were also measured. The correlation of H2S content with the above indices was analyzed.RESULTSCompared with control group, severe injuries of the lung tissues, raised LW/BW, MDA concentration, PMN and protein contents in BALF were observed in IR group. Limb IR also made a drop in the concentration of plasma H2S and the activity of lung CSE, while the activity of iNOS and HO in the lung tissues and the levels of plasma NO and CO increased. Administration of NaHS before IR attenuated the changes induced by IR, while pre-administration of PPG exacerbated the IR injuries and increased the plasma NO level and lung iNOS activity. The H2S content was positively correlated with CSE activity, CO content and HO-1 activity (P<0.01), and negatively correlated with the other indices (P<0.01).CONCLUSIONDown-regulation of H2S/CSE is involved in the pathogenesis of acute lung injury induced by IR. Endogenous and exogenous H2S protects against lung injuries. The anti-injury effects of H2S are related with its anti-oxidative activity to attenuate the inflammatory over-reactions in the lung induced by PMN. Down-regulation of NO/iNOS system and up-regulation of CO/HO-1 system by H2S are also involved in the process of anti-injury to ALI.

Hydrogen sulfide; Acute lung injury; Nitric oxide; Carbon monoxide; Cystathionine-γ-lyase

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.002

1000-4718(2011)01-0009-05

2010-08-19

2010-10-27

國家自然科學基金資助項目(No.30271337; No. 30800440;No.81070050)；北京市自然科學基金資助項目(No.7092035)

△ 通訊作者 Tel：010-85231240; E-mail: junlinzhou@yahoo.cn