康傳利，張偉國，葛向陽，周杰民

(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122)

谷氨酸棒桿菌耐高溫馴化及發(fā)酵條件研究

康傳利，張偉國*，葛向陽，周杰民

(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122)

通過逐級傳代馴化的方式，逐步提高菌體的耐高溫性能。經(jīng)過多次馴化，獲得一株耐高溫菌株，并且在發(fā)酵過程中最大菌濃、產(chǎn)酸率、糖酸轉(zhuǎn)化率均有提高。在此基礎(chǔ)上，又對該菌的發(fā)酵條件進(jìn)行了初步優(yōu)化。首先對發(fā)酵溫度進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)最適發(fā)酵溫度為36℃。然后又采用Plackett－Burman實驗，找出影響發(fā)酵最大的三個因素:玉米漿、葡萄糖和磷酸氫二鉀。最后又進(jìn)行了三因素三水平的響應(yīng)面實驗，得到三個重要影響因素的最佳濃度為葡萄糖161.98g/L，玉米漿3.64g/L，磷酸氫二鉀1.51g/L。在此培養(yǎng)條件下，用7L罐發(fā)酵，最終產(chǎn)酸達(dá)114.2g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)61.4%。

谷氨酸棒桿菌，耐高溫，馴化，Plackett Burman設(shè)計，響應(yīng)曲面法

L－谷氨酸是非必需氨基酸，也是世界上銷售量最大的氨基酸，而我國是谷氨酸生產(chǎn)第一大國。目前，我國的味精相關(guān)產(chǎn)品發(fā)展迅速，產(chǎn)量高居世界首位，年需求量為119萬 t。味精年人均占有量為769g，而臺灣和港澳地區(qū)為 2500g，兩者相差甚遠(yuǎn)［1］，市場需求較大，發(fā)展前景廣闊。在夏季高溫季節(jié)，要控制谷氨酸發(fā)酵溫度為32℃，需采取一系列的降溫措施，這無形中增加了生產(chǎn)的成本。特別是我國南部的味精廠，提高菌株的耐高溫性能可減少因維持發(fā)酵溫度所造成的能源浪費。為了減少降溫所帶來的費用和麻煩，篩選耐高溫菌是行之有效的方法［2］。況且在較高的溫度下，菌種體內(nèi)的酶活較高，有利于L－谷氨酸的積累。已有很多關(guān)于谷氨酸菌種選育及發(fā)酵條件優(yōu)化相關(guān)的報道，但有關(guān)提高谷氨酸菌種耐高溫性能的報道很少。鑒于此，本文利用生物素缺陷型菌株為出發(fā)菌株，對其進(jìn)行耐高溫馴化與篩選，提高菌株對高溫的耐受性，從而解決夏季L－谷氨酸發(fā)酵降溫難、成本高的問題;然后又對其最適發(fā)酵溫度進(jìn)行了研究;而后采用Plackett－Burman設(shè)計法研究了發(fā)酵培養(yǎng)基中各成分對L－谷氨酸產(chǎn)率的影響，篩選出影響最顯著的三個因素，又通過響應(yīng)曲面實驗確定三個營養(yǎng)成分的最佳濃度，以使其發(fā)酵性能得到充分的發(fā)揮。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)HCJ46 江南大學(xué)生物工程學(xué)院代謝調(diào)控與代謝工程研究室保藏菌種;葡萄糖 工業(yè)級，山東西王生化科技有限公司;玉米漿 華北制藥康欣有限公司;尿素 上海生化試劑公司;K2HPO4·3H2O 中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司;FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O 鷹潭生物化學(xué)制品廠;MnSO4·4H2O 上海試劑二廠;完全培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖5、牛肉膏10、蛋白胨10、NaCl 5、瓊脂 20，調(diào) pH7.0～7.2，121℃下滅菌20min;種子培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖25、K2HPO4·3H2O 1.5、MgSO4·7H2O 0.4、玉米漿 35、尿素 5，調(diào)pH7.0～7.2，121℃下滅菌20min;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖 140、K2HPO4·3H2O 2.0、MgSO4.7H2O 0.8、玉米漿 3.0、尿素 5.5，調(diào) pH7.0～7.2，115℃ 下滅菌10m in。

1.2 實驗方法

1.2.1 馴化方法 按 KiBeom Lee［3］和楊森蓮［4］等的方法進(jìn)行谷氨酸棒桿菌的馴化，馴化時開始選擇溫度32℃，在后面的實驗過程中根據(jù)菌體生長情況逐漸提高培養(yǎng)溫度(分別是34、36、37、38℃)。

1.2.2 平板分離方法 蘸取馴化后的發(fā)酵液于完全平板上劃線，高溫條件下(分別是34、36、37、38℃)培養(yǎng)20～24h，挑選生長較好的單菌落接種于保藏斜面中。

1.2.3 搖瓶初篩方法 將平板分離得到的菌株分別接種于搖瓶培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，以原菌種作對照，每株 1 瓶，在高溫條件下(分別是34、36、37、38℃)培養(yǎng)36h，淘汰產(chǎn)酸較低的菌株，將產(chǎn)酸較高的菌株進(jìn)行保藏。

1.2.4 搖瓶復(fù)篩方法 將初篩得到的菌株分別接入種子培養(yǎng)基中，待其長到對數(shù)生長期后期，再以6%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，每株菌接三瓶，以原始菌株做對照，在高溫條件下培養(yǎng)36h，保藏產(chǎn)酸最高的一株菌。

1.2.5 7L罐培養(yǎng)方法 發(fā)酵罐中裝液量3.5L，接種量8%，通風(fēng)2L/min，流加氨水控制pH7.0～7.2，通過流加泡敵消泡，發(fā)酵過程中視殘?zhí)乔闆r補加800g/L的糖溶液。根據(jù)溶氧需求調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，發(fā)酵32h。

1.3 分析方法

1.3.1 pH測定 國產(chǎn)精密pH試紙和PHS－3C型精密pH計測定。

1.3.2 OD的測定 取發(fā)酵液稀釋25倍后，在波長620nm條件下測量吸光度。

1.3.3 發(fā)酵液中還原糖及L－谷氨酸含量的測定 采用SBA－40C生物傳感分析儀測定。

1.3.4 糖酸轉(zhuǎn)化率的計算方法 糖酸轉(zhuǎn)化率(%)=L－谷氨酸終濃度×發(fā)酵液終體積/(初糖總量+流加糖總量)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 谷氨酸棒桿菌的耐高溫馴化［5］

首先對出發(fā)菌株的耐高溫性能進(jìn)行研究，如圖1所示。由圖1可知，當(dāng)溫度高于34℃時，發(fā)酵后期菌體衰亡嚴(yán)重，菌濃下降較大，并且隨著溫度升高，菌濃下降幅度越來越大，發(fā)酵過程中最大菌濃也逐漸變小。

圖1 溫度對出發(fā)菌株生長的影響

馴化選擇的初始溫度為33℃，平板、種子及發(fā)酵培養(yǎng)基均在此條件下培養(yǎng)。先培養(yǎng)種子，待其長到對數(shù)生長期后期，將其以6%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。待發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌體長到穩(wěn)定期，再轉(zhuǎn)接到下一級種子培養(yǎng)基中，馴化過程中根據(jù)菌體生長情況逐漸提高培養(yǎng)溫度［3］。

取未經(jīng)馴化的菌體和馴化后的菌體接入發(fā)酵培養(yǎng)基，每4h取一次樣，測定菌體量、產(chǎn)酸量和殘?zhí)?，并對其進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2。經(jīng)過多次馴化，菌體生長速率加快，最大菌體量也有所增加，但未經(jīng)馴化的菌體在高溫條件下培養(yǎng)，后期菌體衰亡嚴(yán)重，馴化后的菌體基本無衰亡現(xiàn)象。馴化后葡萄糖消耗速率也明顯增加，這可能由于經(jīng)過馴化，菌體量逐漸增加，從而導(dǎo)致耗糖速率加快，而且提高溫度后菌體內(nèi)代謝旺盛，耗糖速率更快。由圖2可知，馴化后菌體已適應(yīng)高溫環(huán)境，產(chǎn)酸速率明顯加快，特別是發(fā)酵后期產(chǎn)酸速率較馴化前有較大提高，這可能由于經(jīng)馴化后的后期菌體衰亡不明顯，仍能保持極高的發(fā)酵強度，最終產(chǎn)酸為95.5g/L。

圖2 馴化前后菌濃、殘?zhí)羌癓－谷氨酸產(chǎn)量變化曲線

由以上討論可以看出，馴化后菌株的發(fā)酵情況明顯好于馴化之前的菌株，菌種逐步適應(yīng)高溫的生長環(huán)境。這說明微生物具有一定的適應(yīng)環(huán)境的能力，對環(huán)境的變化，微生物細(xì)胞內(nèi)的代謝會進(jìn)行自我調(diào)節(jié)，使其適應(yīng)新環(huán)境［6］。

2.2 L－谷氨酸發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 L－谷氨酸發(fā)酵最佳溫度的選擇 在影響細(xì)菌生長和產(chǎn)酸的因素中，溫度起著重要作用。為了使微生物生長最快和產(chǎn)酸率最高，必須根據(jù)菌種的特性，選擇和控制最適的培養(yǎng)溫度。如果溫度控制過低，菌體生長慢，酶活低，不利于菌體生長和產(chǎn)酸。若溫度控制過高，雖能提高酶反應(yīng)速率，但易引起菌種衰老，影響最終產(chǎn)酸［7］。

主要考察了 33、34、35、36、37、38℃六個溫度水平下L－谷氨酸的發(fā)酵情況，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)溫度控制在36℃時產(chǎn)酸率和轉(zhuǎn)化率均較高，故選擇發(fā)酵溫度為36℃。由此可見，經(jīng)過耐高溫馴化，菌株發(fā)酵的最適溫度得到了提高(馴化前最適發(fā)酵溫度為32℃)，從而進(jìn)一步提高了該菌株的產(chǎn)酸水平。

表1 Plackett Burman實驗設(shè)計及結(jié)果

圖3 溫度對L－谷氨酸發(fā)酵的影響

2.2.2 Plackett－Burman 實 驗 設(shè) 計 及 分 析［8－10］Plackett－Burman設(shè)計法是一種兩水平實驗優(yōu)化法，它可以用最少的實驗次數(shù)，從眾多影響因素中快速地篩選出影響最顯著的幾個因素，為進(jìn)一步的研究提供指導(dǎo)［11］。實驗考察葡萄糖、玉米漿、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸亞鐵、VB1七個因素對L－谷氨酸發(fā)酵的影響，以L－谷氨酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，比較各因素對最終產(chǎn)酸的影響，實驗設(shè)計及結(jié)果見表1。Xn分別代表各因素，因?qū)嶒炛豢紤]7個因素，其余3因素(X1、X2、X3)均為虛擬項，用以估計實驗誤差。各因素所代表的水平及相對重要性見表2。

表2 Plackett－Burman實驗設(shè)計各因素、水平及相對重要性

表2中P值越小，說明該因素對產(chǎn)酸的影響越顯著，即葡萄糖、玉米漿和磷酸氫二鉀3個因素對L－谷氨酸產(chǎn)量有顯著影響，故選擇這三個因素進(jìn)行響應(yīng)曲面實驗，進(jìn)一步研究它們對產(chǎn)酸的影響。

2.2.3 響應(yīng)面法實驗設(shè)計及結(jié)果［12－14］由前面的Plackett－Burman實驗可知，影響L－谷氨酸發(fā)酵的主要營養(yǎng)成分為葡萄糖、玉米漿和磷酸氫二鉀。采用Box－Behnken中心組合，設(shè)計了三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，以L－谷氨酸產(chǎn)量為指標(biāo)作響應(yīng)面，以期找到各因素的最佳濃度，因素水平的見表3。

表3 實驗因素水平表

用軟件Design expert7.1進(jìn)行實驗設(shè)計，共進(jìn)行17次實驗，17個實驗點可分為兩類，一類是析因點，即自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點，一共有12個析因點;另一類稱為零點，為響應(yīng)面區(qū)域的中心點，零點實驗重復(fù)5次，用于實驗誤差估計，實驗結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面實驗設(shè)計及實驗結(jié)果

根據(jù)上述實驗結(jié)果，以L－谷氨酸的產(chǎn)量Y為響應(yīng)值，利用Design Expert7.1軟件對表4進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到L－谷氨酸產(chǎn)量對編碼自變量X1，X2，X3的二次多項回歸方程:Y=101.13+17.27X1－1.49X2+2.49X3+2.84 X1X2－0.71X1X3－0.97X2X3－13.32－5.18－5.07?；貧w分析表明，大于F值的概率(Pr＞F)小于0.0001，說明回歸方程的顯著性及可靠性極高;該決定系數(shù)R2=0.9831，這表示方程的擬合度較高，可用于分析和預(yù)測L－谷氨酸產(chǎn)量。本設(shè)計實驗中 CV=2.32%，較低，說明實驗操作可信。

應(yīng)用Design－Expert7.1軟件將二次回歸模型進(jìn)行規(guī)范分析，得到三個影響因子相互之間的響應(yīng)面立體圖，見圖4～圖6。通過該組圖可以了解任何兩因素對L－谷氨酸積累的交互影響。

圖4 玉米漿(X1)及磷酸氫二鉀(X2)對L－谷氨酸發(fā)酵影響的響應(yīng)面圖

圖5 玉米漿(X1)與葡萄糖(X3)對L－谷氨酸發(fā)酵影響的響應(yīng)面圖

圖6 磷酸氫二鉀(X2)與葡萄糖(X3)對L－谷氨酸發(fā)酵影響的響應(yīng)面圖

由圖4～圖6可知，回歸模型存在穩(wěn)定點，穩(wěn)定點即最大值，利用回歸方程分別對X1、X2、X3求偏導(dǎo)，令導(dǎo)數(shù)等于0，得到的最佳點:X1=0.645，X2=0.013，X3=0.198，Y=106.932。換算成實驗條件:葡萄糖161.98g/L，玉米漿 3.64g/L，磷酸氫二鉀 1.51g/L，L－谷氨酸產(chǎn)量最高值為106.932g/L。為了驗證預(yù)測值與實際值之間的擬合程度，以上面三因子的最優(yōu)濃度進(jìn)行搖瓶實驗，五次實驗后測得L－谷氨酸產(chǎn)量接近，平均值為105.6g/L，與預(yù)測值十分相近，證明了該模型具有很高的可信度。

2.3 優(yōu)化條件下的耐高溫菌株發(fā)酵過程曲線

在優(yōu)化的條件下，經(jīng)7L罐發(fā)酵，發(fā)酵過程中菌濃(OD620)、殘?zhí)?Rg)及產(chǎn)酸(Glu)變化情況見圖7。由該圖7可知，菌體生長基本無延滯期，發(fā)酵后期菌體衰亡不嚴(yán)重，最大OD達(dá)1.05。在整個發(fā)酵過程中均能保持較高的耗糖速率和產(chǎn)酸速率，最終產(chǎn)酸達(dá)114.2g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為61.4%，達(dá)到了高產(chǎn)率和高轉(zhuǎn)化率的統(tǒng)一。

圖7 優(yōu)化條件下的發(fā)酵過程曲線

3 結(jié)論

以生物素缺陷型菌株為出發(fā)菌株，經(jīng)過耐高溫馴化，使其耐高溫性能得到提高，并且發(fā)酵過程中最大菌濃、產(chǎn)谷氨酸量和糖酸轉(zhuǎn)化率均有提高。然后對其發(fā)酵條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，首先對其最適發(fā)酵溫度進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)36℃為最適發(fā)酵溫度。而后采用Plackett－Burman設(shè)計實驗，結(jié)果表明玉米漿、葡萄糖和磷酸氫二鉀對L－谷氨酸發(fā)酵影響最顯著。在此基礎(chǔ)上，又采用三因素三水平的響應(yīng)面方法對發(fā)酵培養(yǎng)基繼續(xù)優(yōu)化，得到三個重要影響因素的最佳濃度為葡萄糖161.98g/L，玉米漿3.64g/L，磷酸氫二鉀1.51g/L。在此培養(yǎng)條件下，用7L罐發(fā)酵，最終產(chǎn)酸達(dá)114.2g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)61.4%。

雖然通過本研究提高了菌體的耐高溫性能，但發(fā)酵過程中采取單一的溫度控制方式(36℃)不能取得最佳的發(fā)酵結(jié)果，因為菌體生長的最適溫度和產(chǎn)酸的最適溫度不同。所以在以后的研究中還要對分階段溫度控制策略進(jìn)行深入探討。

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Domestication of thermotolerant Corynebacterium glutamicum and study on its fermentation condition

KANG Chuan－li，ZHANG Wei－guo*，GE Xiang－yang，ZHOU Jie－m in

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

The thermotolerant property of Corynebacterium glutamicum was improved gradually via a passage transfer approach.After many times of domestication，a thermotolerant strain was obtained.And also，the maximum cell concentration，L－glutamic acid productivity，conversion rate had been increased in fermentation course.The fermentation condition of this strain was further studied.Firstly，the fermentation temperature was studied and found the optimal temperature was 36℃.Then，the top three factors were found out by Plackett－Burman experiment，which were corn steep liquor，glucose and K2HPO4.Finally，three factors and three levers of response surface experiment were carried out.The optimal concentrations of the three important factors were obtained，which were glucose 161.98g/L，corn steep liquor 3.64g/L and K2HPO41.51g/L.At the optimal conditions，the L－glutamic acid concentration reached 114.2g/L and conversion rate reached 61.4%in 7－L bioreactor.

Corynebacterium glutamicum;thermotolerant;domestication;Plackett Burman design;response surface methodology

TS201.3

A

1002－0306(2011)08－0188－05

2010－08－09 *通訊聯(lián)系人

康傳利(1984－)，男，碩士研究生，主要從事菌種選育及發(fā)酵條件優(yōu)化的研究。

國家“863”計劃項目(2006AA020301)。