李 祝，郁建平，任秀秀，陳 青，周禮紅，葛永怡，肖 洋，劉吳娟

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025;2.畢節(jié)學(xué)院環(huán)生系，貴州畢節(jié) 551700;3.貴州大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025;4.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州貴陽(yáng) 550003)

發(fā)酵成分對(duì)輪枝擬青霉中蟲(chóng)草菌素含量的影響

李 祝1，郁建平1，任秀秀2，陳 青3，周禮紅1，葛永怡1，肖 洋4，劉吳娟1

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025;2.畢節(jié)學(xué)院環(huán)生系，貴州畢節(jié) 551700;3.貴州大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025;4.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州貴陽(yáng) 550003)

以輪枝擬青霉(Paecilomyces verticillatus GZ)為材料，通過(guò)單因素、正交實(shí)驗(yàn)考察不同的發(fā)酵成分對(duì)提高GZ高產(chǎn)蟲(chóng)草菌素的條件，通過(guò)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)考察GZ菌株的收菌時(shí)間。結(jié)果表明:以白砂糖2%、麥芽糖1%、牛肉膏3%、酵母膏2%為發(fā)酵培養(yǎng)基，140r/min，26℃，搖瓶培養(yǎng)7d，蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量為(69.1±0.921)mg/L。

輪枝擬青霉，蟲(chóng)草菌素，發(fā)酵

蟲(chóng)草菌素(cordycepin)是一類首次從蛹蟲(chóng)草中分離出來(lái)的核苷類抗菌物［1］，有抑菌、抗腫瘤、抑制病毒、殺蟲(chóng)等作用［2－4］，已經(jīng)引起了醫(yī)藥學(xué)界等的廣泛重視。隨著市場(chǎng)對(duì)蟲(chóng)草菌素的需求越來(lái)越多，而野生的蛹蟲(chóng)草中蟲(chóng)草菌素含量不高，一般為0.1%或更低，很難滿足商業(yè)蟲(chóng)草菌素含量要達(dá)2%的要求［5］。隨著野生的冬蟲(chóng)夏草的價(jià)格一路上漲，目前已經(jīng)漲至20萬(wàn)元/kg左右，使野生蛹蟲(chóng)草受到瘋狂采摘。所以從資源保護(hù)方面考慮，尋找能夠產(chǎn)蟲(chóng)草菌素的蛹蟲(chóng)草替代菌株，擴(kuò)大蟲(chóng)草菌素的藥源，是極需要解決的問(wèn)題。2003年李祝等人從貴州省貴陽(yáng)市森林公園土壤中分離鑒定得到一株輪枝擬青霉［6］，經(jīng)紫外分光光度法和高效液相色譜法測(cè)其發(fā)酵能夠產(chǎn)生蟲(chóng)草菌素，而研究輪枝擬青霉的培養(yǎng)成分優(yōu)化并確定其生長(zhǎng)曲線，是提高發(fā)酵產(chǎn)蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量的方法。所以選擇合適的發(fā)酵成分對(duì)于提高蟲(chóng)草菌素的產(chǎn)量有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

輪枝擬青霉(Paecilomyces verticillatus GZ) 以下簡(jiǎn)稱GZ，現(xiàn)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué))，保藏號(hào):CCTCC，NO:M 209302;蛹蟲(chóng)草擬青霉(Peacilomycesmilitaris 08－03) 以下簡(jiǎn)稱 08－03，現(xiàn)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué))，保藏號(hào):CCTCC，NO:M 20100219;PDA斜面培養(yǎng)基 馬鈴薯200g，切塊，用水煮沸30min，過(guò)濾取汁，加葡萄糖20g，瓊脂 20g，水補(bǔ)足 1000m L，pH 自然，滅菌條件:121℃，30m in;PDA液體培養(yǎng)基 馬鈴薯200g，切塊，用水煮沸30min，過(guò)濾取汁，加葡萄糖20g，水補(bǔ)足1000m L，pH 自然，滅菌條件:121℃，30min;查氏固體培養(yǎng)基 NaNO32g，K2HPO41g，KCl 0.5g，MgSO40.5g，F(xiàn)eSO40.01g，蔗糖 30g，瓊脂 17～20g，水 1000m L，pH自然，滅菌條件:121℃，30m in;基礎(chǔ)培養(yǎng)基1 蛋白胨2%，不添加任何其他物質(zhì)，pH自然，滅菌條件:121℃，30m in;基礎(chǔ)培養(yǎng)基2 葡萄糖2%，不添加任何其他物質(zhì)，pH自然，滅菌條件:121℃，30m in;發(fā)酵培養(yǎng)基 白砂糖20g，麥芽糖10g，酵母膏20g，牛肉膏30g，水補(bǔ)足1000m L，pH自然，滅菌條件:121℃，30m in;蟲(chóng)草菌素 3'－deoxyadenosine，分析純，美國(guó)Sigma公司;白砂糖，麩皮，魚(yú)粉，黃豆粉 均為市售;其它均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單因素篩選 碳源的選擇:以白砂糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、甘油、麩皮、可溶性淀粉為八種碳源分別加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基1中，添加量為4%，其中麩皮、玉米粉經(jīng)煮沸水解20min，過(guò)濾取其上清液加入。制備培養(yǎng)基，培養(yǎng)基裝量為40%，將種子液以5%(v/v)接種量接入不同培養(yǎng)基中，140 r/m in，26℃，搖瓶培養(yǎng)5d，對(duì)比這八種碳源對(duì)生物量及蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量的影響。

氮源的選擇:以蛋白胨、酵母膏、NaNO3、乙酸銨、魚(yú)粉、黃豆粉、牛肉膏、(NH)2SO4為八種氮源分別加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基2中，添加量為4%，其中魚(yú)粉、黃豆粉經(jīng)煮沸水解20m in，取其上清液加入。制備培養(yǎng)基，培養(yǎng)基裝量為40%，將種子液以5%(v/v)接種量接入不同的培養(yǎng)基中，140r/min，26℃，搖瓶培養(yǎng)5d，對(duì)比這八種氮源對(duì)生物量及蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量的影響。

1.2.2 碳氮比的選擇 分別選出蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量最高的兩種碳源、氮源，不加其他任何成分，按四因素三水平設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，考察不同碳氮比對(duì)蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量及生物量的影響。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線的繪制 將活化好的菌株接種于種子培養(yǎng)液中，26℃，140 r/m in，搖床發(fā)酵培養(yǎng)，每天取出3瓶觀察其形態(tài)，將發(fā)酵液和菌絲體一起轉(zhuǎn)置離心管中，4000 r/m in離心20m in，進(jìn)行菌液分離，去其上清液，用雙蒸水沖洗菌絲，再離心，如此重復(fù)三次。得到基本無(wú)培養(yǎng)基的菌絲體，將其置于電熱干燥箱中，55℃烘干至恒重，取出并測(cè)定其重量，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 蟲(chóng)草菌素標(biāo)準(zhǔn)液的制備 精密稱取1.00mg蟲(chóng)草菌素，置于10m L容量瓶中，用乙醇溶液溶解定容至刻度，即得蟲(chóng)草菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于冰箱內(nèi)備用。1.2.5 待測(cè)液的制備 待測(cè)液A液的制備:待發(fā)酵完成后，用吸管吸出有機(jī)溶劑，經(jīng)0.45μm油相微濾膜過(guò)濾除去雜質(zhì)后冷藏，待測(cè)。

待測(cè)液B液的制備:將除去有機(jī)相的發(fā)酵液和菌絲體一起轉(zhuǎn)置離心管中，4000 r/min離心20m in，進(jìn)行菌液分離，取其上清液經(jīng)0.45μm水相微濾膜過(guò)濾除去雜質(zhì)后冷藏，待測(cè)。

待測(cè)液C液的制備:將除去有機(jī)相的發(fā)酵液和菌絲體一起轉(zhuǎn)置離心管中，4000 r/min離心20m in，進(jìn)行菌液分離，去其上清液，用雙蒸水沖洗菌絲，再離心，如此重復(fù)二次。得到基本無(wú)培養(yǎng)基的菌絲體，將其置于電熱干燥箱中，55℃烘干至恒重，研磨，過(guò)60目篩，得菌絲粉。精密稱取干菌絲粉0.05g置于試管中，加入20%乙醇10m L，超聲處理30m in，經(jīng)0.45μm水相微濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.2.6 蟲(chóng)草菌素的測(cè)定 HPLC采用Agilent 1100分析檢測(cè)，色譜柱采用Kromasil C18(4.6mm×250mm，5μL praticle size，Scientific systems Inc，AP，USA);紫外檢測(cè)儀(model:Laballiance 525，Scientific systems Inc.，PA，USA);流動(dòng)相:10mmol/L KH2PO4溶于甲醇/雙蒸水(15∶85)，柱溫25℃，流速為1.0m L/m in，檢測(cè)波長(zhǎng)為 259nm，進(jìn)樣量為 10μL，出峰時(shí)間為22.3min。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行三次重復(fù)，所有數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS17(正交實(shí)驗(yàn))和Minitab15(除正交實(shí)驗(yàn)外其余實(shí)驗(yàn))分析軟件統(tǒng)計(jì)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源的影響

碳源不僅存在于微生物細(xì)胞的原生質(zhì)及其代謝產(chǎn)物中，而且是生命活動(dòng)中主要的能量來(lái)源，因此，碳源不僅需要量大且是基本的營(yíng)養(yǎng)元素之一。

表1表明，不同碳源對(duì)生物量和蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量的影響差異顯著(P＜0.05)。碳源的添加均能使GZ的生物量增加，不同的碳源對(duì)生物量的影響不同，其中添加白砂糖、麥芽糖后生物量增加明顯，但是麩皮最不利于GZ的生長(zhǎng)。可見(jiàn)GZ菌株較易于吸收糖類和淀粉類碳源，不易利用纖維素類碳源。

表1 不同碳源的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

白砂糖、麥芽糖作碳源，蟲(chóng)草菌素的產(chǎn)量最高，分別為(30.7±0.311)mg/L和(26.2±0.117)mg/L，因此確定白砂糖和麥芽糖為最適碳源。

2.2 氮源的影響

氮源是合成蛋白質(zhì)的主要原料，而蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要組成成分，是保持生命的基本物質(zhì)，因此，氮源是微生物生長(zhǎng)所需的主要營(yíng)養(yǎng)源。

表2表明，不同氮源對(duì)生物量和蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量的影響差異顯著(P＜0.05)。不同氮源的添加均能使GZ菌株生物量增加，不同的氮源對(duì)生物量的影響不同，其中添加蛋白胨、牛肉膏增加最明顯，NaNO3、乙酸銨、硫酸銨則不易于菌株的生長(zhǎng)。這可能是由于:首先，GZ菌株為異養(yǎng)微生物，對(duì)無(wú)機(jī)氮源利用差;其次，乙酸銨和硫酸銨作為氮源被利用時(shí)，隨著銨鹽的吸收，培養(yǎng)基pH發(fā)生改變，菌株的生長(zhǎng)受到一定影響。

表2 不同氮源的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2還顯示，不同氮源的添加對(duì)蟲(chóng)草菌素的產(chǎn)生有不同影響，一些氮源的添加未見(jiàn)GZ蟲(chóng)草菌素的產(chǎn)生，但有一些氮源的添加能夠提高蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量。推測(cè)GZ產(chǎn)蟲(chóng)草菌素的條件需要某些物質(zhì)的誘導(dǎo)，蛋白質(zhì)類物質(zhì)較利于GZ菌株誘導(dǎo)蟲(chóng)草菌素產(chǎn)生，而銨鹽或硝酸鹽物質(zhì)則不利于誘導(dǎo)蟲(chóng)草菌素產(chǎn)生。

牛肉膏、酵母膏作為氮源時(shí)的蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量最高，分別為(24.3±0.117)mg/L和(27.3±0.211)mg/L，因此確定牛肉膏、酵母膏為最適氮源。

2.3 碳氮比的影響

培養(yǎng)基中的碳源和氮源的相對(duì)比例無(wú)論是對(duì)菌絲生長(zhǎng)還是對(duì)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生都有著十分重要的意義。

將篩選出來(lái)的兩種碳源和氮源，根據(jù)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表安排實(shí)驗(yàn)，以蟲(chóng)草菌素含量為檢測(cè)指標(biāo)，結(jié)果(表3)顯示，R值表明白砂糖(A)對(duì)蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量的影響最為顯著，其次為牛肉膏(C)、麥芽糖(B)和酵母膏(D)。各因素的最佳組合為A2B1C3D2，即最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:白砂糖2%、麥芽糖1%、牛肉膏3%、酵母膏2%。

表3 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析表

2.4 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的考察

菌株 GZ 在分別培養(yǎng) 0、1、2、3、4、5、6、7、8d 后，測(cè)其生物量和蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量。

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期形成的產(chǎn)物是細(xì)胞自身生長(zhǎng)所必需的，稱為初級(jí)代謝產(chǎn)物或中間代謝產(chǎn)物。次級(jí)代謝產(chǎn)物來(lái)自于中間代謝產(chǎn)物和初級(jí)代謝產(chǎn)物，所以，針對(duì)不同的代謝產(chǎn)物，其發(fā)酵菌絲體收集的時(shí)間會(huì)有所差異，菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定為發(fā)酵菌絲體的收集時(shí)間提供依據(jù)。

圖1表明，GZ在發(fā)酵的1～2d，生物量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)增長(zhǎng)十分緩慢(延遲期)，但發(fā)酵到第3d，其生物量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)增長(zhǎng)迅速(指數(shù)期)，到第3～4d時(shí)生物量增加較為平緩(第一個(gè)穩(wěn)定期)，第5d后生物量又有一次較明顯的增加趨勢(shì)，形成二次生長(zhǎng)趨勢(shì)，發(fā)酵到第6～7d時(shí)無(wú)繼續(xù)增加的趨勢(shì)(第二個(gè)穩(wěn)定期)，第8d后GZ菌株生物量則隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降(衰老期)。

圖1 GZ菌株的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

GZ菌株在培養(yǎng)第3d(第一個(gè)穩(wěn)定期)時(shí)蟲(chóng)草菌素產(chǎn)生，在培養(yǎng)至第3～6d(第二個(gè)穩(wěn)定期之前)，蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量得到積累，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蟲(chóng)草菌素的產(chǎn)量增加，在培養(yǎng)第7d(第二個(gè)穩(wěn)定期結(jié)束)時(shí)含量達(dá)到最大，為(69.1±0.921)mg/L，此時(shí)，生物量也為最高，為(5.8±0.23)mg/m L，隨后降低。由此可見(jiàn)，次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和菌株的生長(zhǎng)周期有關(guān)，次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累主要是在菌株的穩(wěn)定期。因此，確定培養(yǎng)7d為GZ菌株最適發(fā)酵時(shí)間。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素、正交實(shí)驗(yàn)及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的考察，確定了GZ菌株產(chǎn)蟲(chóng)草菌素的條件，即白砂糖2%、麥芽糖1%、牛肉膏3%、酵母膏2%為發(fā)酵培養(yǎng)基，種子液以5%(v/v)接種量接入，140 r/m in，26℃，搖瓶培養(yǎng)7d，蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量為(69.1±0.921)mg/L。

［1］焦彥朝，梁宗琦，劉愛(ài)英，等.蟲(chóng)草生物活性物質(zhì)研究概況［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，1990(3):53－54.

［2］R J蘇哈道尼克著.核苷類抗菌素［M］.謝其明，王恕蓉譯.北京:科學(xué)出版社，1982:476.

［3］汪洪.蟲(chóng)草開(kāi)發(fā)研究中幾個(gè)問(wèn)題的探討［J］.農(nóng)牧產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，1999(6):12－13

［4］吳洪臻，江偉，馬德恩.蟲(chóng)草菌素對(duì)小鼠S180瘤抑制作用研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2000，11(10):873－874.

［5］李林，張悅紅.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程［M］.化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

［6］Zhu Li，Yanfeng Han，Zongqi Liang.Paecilomyces verticillatus，a new species isolated from soil in China［J］.MYCOTAXON，2006，95(3):133－136.

Effect of the components of medium on the content of cordycepin from Paecilomyces verticillatus mycelia

LI Zhu1，YU Jian－ping1，REN Xiu－xiu2，CHEN Qing3，ZHOU Li－h(huán)ong1，GE Yong－yi1，XIAO Yang4，LIU Wu－juan1

(1.College of Life Science of Guizhou University，Guiyang 550025，China;
2.Envirenment and Life Science Department of Bijie University，Bijie 551700，China;
3.College of Chemical Engineering of Guizhou University，Guiyang 550025，China;
4.Institute of Products Detection ＆ Determination of Guizhou Province，Guiyang 550003，China)

The optimum media condition for submerged fermentation of Paecilomyces verticillatus GZ was explored to enhance cordycepin content.It was found that the optimum conditions were as follows:2%sugar，1%maltose，3%extraction beef，2%extraction yeast，140r/m in，26℃，fermentation for 7 days，the cordycep in production from GZ mycelia would reach(69.1±0.921)mg/L.

Paecilomyces verticillatus;cordycep in;fermentation

TS201.3

A

1002－0306(2011)08－0223－03

2010－12－20

李祝(1978－)，女，副教授，博士，研究方向:微生物與藥物活性研究。

貴州大學(xué)引進(jìn)人才科研基金［貴大人基合字(2008)007號(hào)］;貴州省科學(xué)技術(shù)基金［黔科合J字(2010)2065號(hào)］;貴大人基合字(2008)013號(hào);畢節(jié)地區(qū)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)科技合作專項(xiàng)［畢署科［2010］04號(hào)］。