于國(guó)才，何 慧*，靳 楨，黃文浩，李江濤

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

納濾技術(shù)濃縮純化玉米肽及對(duì)其醒酒活性的影響

于國(guó)才，何 慧*，靳 楨，黃文浩，李江濤

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

探討納濾技術(shù)濃縮純化玉米肽的過程中肽的醒酒活性的變化。本研究選用截留分子質(zhì)量160D和360D的兩種納濾膜，對(duì)pH8.0玉米肽液(Mw＜5kD)進(jìn)行濃縮純化，比較兩種膜對(duì)其中主要成分的傳質(zhì)效果，并進(jìn)一步探討透析過濾過程對(duì)玉米肽醒酒活性的影響。結(jié)果表明，玉米肽液濃縮過程中，相對(duì)于360D納濾膜，160D納濾膜對(duì)肽類、氨基酸和Na+均具有較低的傳質(zhì)效率，但其對(duì)玉米肽的截留率卻在88.80%以上，脫鹽效果與360D膜相當(dāng)，經(jīng)3次透析后，脫鹽率達(dá)94.6%，且160D納濾膜在透析過程中很好地保持玉米肽對(duì)乙醇脫氫酶(ADH)的激活作用。結(jié)論：宜選用160D納濾膜對(duì)玉米肽液進(jìn)行濃縮純化，透析過濾3次。

納濾；玉米肽；醒酒；透析；脫鹽；乙醇脫氫酶

納濾是一種新型的膜分離技術(shù)，其在有機(jī)化合物的分離中具有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，特別適合于分離熱敏性物質(zhì)如果汁、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸等，且對(duì)單價(jià)離子截留率很低[1]，因此被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，尤其是飲料行業(yè)加工過程中料液的分級(jí)分離、濃縮和脫鹽等[2]。蛋白質(zhì)水解液成分相當(dāng)復(fù)雜，其中很多肽類或氨基酸分子質(zhì)量相近、性質(zhì)相似，有的僅是凈電荷數(shù)的不同。相對(duì)于超濾膜單純基于篩分原理進(jìn)行的分離而言，納濾膜技術(shù)對(duì)肽類和氨基酸的分級(jí)分離具有明顯的優(yōu)勢(shì)。納濾膜通過空間位阻和電荷效應(yīng)的共同作用可對(duì)溶液中的肽類和氨基酸進(jìn)行分離[3]，對(duì)分子質(zhì)量200～1000D的化合物分離效果最好[4]。

上世紀(jì)90年代末，Yamaguchi[5]對(duì)玉米肽的醒酒作用進(jìn)行研究，其后相關(guān)工作很少見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室曾對(duì)玉米醒酒肽進(jìn)行一系列的研究[6-7]，并利用超濾技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分級(jí)分離，確定分子質(zhì)量(Mw)＜5kD的玉米肽級(jí)份為醒酒活性最高的級(jí)份[8]。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究納濾技術(shù)對(duì)玉米醒酒肽濃縮脫鹽及其對(duì)活性的影響，為今后開發(fā)專一性的功能性玉米肽產(chǎn)品提供依據(jù)，相關(guān)研究目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

玉米黃粉(corn gluten meal，CGM)(粗蛋白含量為58.84%) 正大集團(tuán)武漢分公司。

Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶 (19.2 IU/g) 丹麥Novozymes公司；乙醇脫氫酶(alchol dehydrogenase，ADH)(451U/mg) 美國(guó)Sigma公司；氧化型輔酶Ⅰ(NAD+) 加拿大Bio Basic Inc公司。

Prepscale切向流1.6L系統(tǒng)超濾設(shè)備及截留分子質(zhì)量5kD的再生纖維素卷式超濾膜(有效膜面積為0.09m2) 美國(guó)Minipore公司；實(shí)驗(yàn)室小型納濾膜設(shè)備LNG-NF-10、截留分子質(zhì)量為360D和160D的聚醚砜卷式膜(有效膜面積均為0.25m2) 上海朗極化工科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 玉米醒酒肽溶液的制備

按文獻(xiàn)[7]方法從玉米黃粉中提取濃縮玉米蛋白→取濃縮蛋白粉適量→按1:25(g/mL)比例加水→沸水浴30min→冷卻→調(diào)pH值至8.0、溫度55℃→加入蛋白粉質(zhì)量的0.8%Alcalase堿性蛋白酶酶解5h(用1mol/L NaOH穩(wěn)定pH8.0) →沸水浴10min滅酶活→酶解液過5kD超濾膜→得到膜透過液。

1.2.2 玉米醒酒肽溶液納濾純化中各指標(biāo)的測(cè)定

上述5kD超濾膜透過液400mL定容至2L，在一定溫度，低壓條件下，分別測(cè)定玉米肽溶液過360D和160D納濾膜濃縮過程中，膜通量(flux，F(xiàn))和膜對(duì)肽的截留率(rejection rate，RR)、氨基酸的傳質(zhì)率(transmission rate，TR)。肽濃度的測(cè)定采用微量雙縮脲法[9]，氨基酸質(zhì)量濃度的測(cè)定采用茚三酮法[10]，Na+濃度的測(cè)定采用火焰光度法。

傳質(zhì)率(TR)= Cp/Cr

截留率(RR)= 1－ TR= 1－Cp/Cr

體積濃縮倍數(shù)(VCF)=Vo/Vr

Na+含量= WNa+/W肽= CNa+/C肽

脫鹽率= 1－(Cr×Vr)/(Co×Vo)

膜通量(F)=Vp/(T×A)

式中：Co、Cp和Cr分別為原液、透過液和截留液中溶質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/L)；W為溶質(zhì)質(zhì)量/mg；Vo、Vp和Vr分別為原液、透過液和截留液體積/L；F為膜通量/(L/m2·h)；T為操作時(shí)間/h；A為膜有效面積/m2。1.2.3 玉米醒酒肽的納濾透析純化

采用透析過濾法對(duì)玉米肽液進(jìn)行進(jìn)一步純化，方法如下：將1.2.2節(jié)中制備的玉米肽液過納濾膜將其濃縮，使其體積濃縮倍數(shù)(volumetric concentration factor，VCF)為4，為第一次透析；再加入適量的去離子水使其與透析前的稀釋倍數(shù)相同，再進(jìn)行第2次透析，至體積濃縮倍數(shù)為4為第2次透析；如此重復(fù)透析5次，每次透析固定納濾壓力2bar，料液溫度(20±1)℃。取原始液及每次透析結(jié)束時(shí)的循環(huán)液各50mL，冷凍干燥，測(cè)定玉米肽凍干粉的各種活性指標(biāo)及Na+濃度。

1.2.4 玉米肽對(duì)羥自由基(·OH)抑制率測(cè)定

采用脫氧核糖-鐵體系法，測(cè)定各級(jí)份玉米肽對(duì)·OH的抑制率[11]。

1.2.5 玉米肽對(duì)乙醇脫氫酶體外激活率的測(cè)定

ADH活性的測(cè)定依據(jù)文獻(xiàn)[12]描述的方法進(jìn)行。1.5mL 32mmol/L pH8.8的磷酸鹽緩沖液，1.0mL 27 mmol/L NAD+溶液，0.5mL 體積分?jǐn)?shù)11.5% 乙醇溶液和 0.1mL 0.1mg/mL 玉米肽(corn peptides，CP)溶液混勻，25℃溫育5min后，加入0.1mL ADH(0.64μg/mL)?？瞻捉M以0.1mL H2O代替0.1mL CP，其他操作相同。搖勻后立即于340nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，每隔10s讀數(shù)一次，連續(xù)測(cè)定5min，取最初線性部分計(jì)算還原型輔酶Ⅰ(NADH)的生成量。

ADH活力/(U/mL)=ΔA×V×DF/(6.22×0.1)

ADH激活率/%= [(Up－Uc)/Uc]×100

式中：ΔA為每分鐘吸光度增加的值；V為反應(yīng)總體積(mL)；DF為稀釋倍數(shù)；0.1為酶溶液的體積/mL；Up和Uc分別為玉米肽組和空白組的ADH活力；6.22為NADH在340nm的毫摩爾消光系數(shù)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS V8統(tǒng)計(jì)軟件，所有的數(shù)據(jù)都以x±s表示，組間t檢驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 膜通量在玉米肽液納濾濃縮過程中的變化

圖1 膜通量在玉米肽液納濾濃縮過程中的變化Fig.1 Change in membrane flux during filtration of corn protein hydrolysate through different NFMs

如圖1 所示，隨著VCF的不斷增大，循環(huán)液的濃度不斷增加，膜污染的程度也不斷加大，造成了兩種納濾膜的膜通量均逐漸下降。在VCF為1～3之間變化時(shí)，360D納濾膜因?yàn)榫哂休^大的膜孔徑，膜通量要高于160D納濾膜的膜通量。后期當(dāng)VCF繼續(xù)增大時(shí)，循環(huán)液體積小于納濾設(shè)備的最小循環(huán)體積(約360mL)時(shí)，會(huì)有空氣進(jìn)入，導(dǎo)致兩者膜通量均較快地下降，并逐漸趨于一致。

2.2 濃縮過程中納濾膜對(duì)玉米肽的截留率(RR)

如圖2所示，相同條件下，160D納濾膜在玉米肽液濃縮過程中對(duì)肽的截留率始終高于360D的納濾膜。160D納濾膜，開始時(shí)對(duì)多肽的截留率為100%，隨后緩慢下降，最后穩(wěn)定于88.8%左右；360D納濾膜，由于孔徑較大，小分子質(zhì)量的多肽易透過膜，因此開始時(shí)，對(duì)肽的截留率只有53.9%，隨著小分子肽逐漸透過膜后，截留率逐漸上升，最后RR亦趨于穩(wěn)定，稍低于160D納濾膜。

圖2 兩種納濾膜對(duì)玉米肽的截留率(RR)隨VCF的變化Fig.2 Plot of rejection rate of CPs against volume concentration factor

2.3 濃縮過程中納濾膜對(duì)游離氨基酸的傳質(zhì)效果

如圖3所示，相同條件下，360D納濾膜在玉米肽液濃縮過程中對(duì)氨基酸的傳質(zhì)率高于160D的納濾膜。在玉米肽液濃縮過程中，兩種膜對(duì)氨基酸的傳質(zhì)率(TR)基本趨勢(shì)均為緩慢下降。納濾過程中，濃縮效應(yīng)和透析效應(yīng)同時(shí)存在，傳質(zhì)率上升表明透析效應(yīng)占主導(dǎo)(如VCF在2～3.6之間)，傳質(zhì)率下降表明濃縮效應(yīng)占主導(dǎo)(如VCF在3.6～5.5之間)。

2.4 納濾膜對(duì)Na+的傳質(zhì)效果

如圖4所示，相同條件下，360D納濾膜在玉米肽液濃縮過程中，對(duì)Na+的傳質(zhì)率始終高于160D的納濾膜。如圖5所示，濃縮過程中玉米肽中Na+的含量不斷下降。多次透析使Na+含量降得更低，且均隨透析次數(shù)的增加而逐漸下降，透析3次之后兩種膜截留產(chǎn)物中的Na+含量相近，脫鹽率在95%左右(圖6)。

圖4 濃縮過程中兩種納濾膜對(duì)Na+的傳質(zhì)率Fig.4 Plot of transmission rate of Na+ against volume concentration factor

圖5 玉米肽中Na+含量在濃縮過程中的變化Fig.5 Plot of Na+ content in CPs against volume concentration factor

圖6 玉米肽中脫鹽率在透析過程的變化Fig.6 Effect of volume concentration factor on desalinization rate

圖3 兩種納濾膜對(duì)游離氨基酸的傳質(zhì)率隨VCF的變化Fig.3 Plot of transmission rate of amino acids against volume concentration factor

2.5 納濾加水透析過濾對(duì)玉米肽活性的影響

2.5.1 玉米肽清除羥自由基能力

乙醇在體內(nèi)代謝會(huì)產(chǎn)生·OH，是引起肝細(xì)胞損傷的重要誘因之一[13]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，玉米肽醒酒能力與清除·OH能力之間存在一定關(guān)系[6-8]。隨著透析次數(shù)的增加，肽的純度不斷提高，玉米肽對(duì)·OH的半數(shù)抑制濃度(IC50)不斷降低(圖7)。對(duì)于360D納濾膜，相同的透析次數(shù)，得到玉米肽對(duì)·OH抑制率的IC50比用160D納濾膜透析得到的產(chǎn)物更低。

圖7 玉米肽對(duì)·OH抑制率(IC50)隨透析過濾次數(shù)的變化Fig.7 Effect of number of repeated dialysis on hydroxyl free radical scavenging ability of CPs

2.5.2 玉米肽對(duì)乙醇脫氫酶(ADH)的激活作用

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，玉米肽能夠直接激活小鼠體內(nèi)ADH活性[14]，從而加速乙醇在體內(nèi)的代謝，并且可以用玉米肽對(duì)ADH的體外激活率作為衡量醒酒活性的主要指標(biāo)[7-8]。經(jīng)過透析過濾后，360D納濾膜透析過濾產(chǎn)物對(duì)ADH的激活率有一定程度的下降，其中透析5次時(shí)激活率與原液比顯著下降(P＜0.05)，而160D納濾膜透析產(chǎn)物對(duì)ADH的激活率基本沒有變化(圖8)。提示透過納濾膜的小分子質(zhì)量的玉米肽(＜360D)，如二肽、三肽等，對(duì)玉米肽激活A(yù)DH的貢獻(xiàn)較大。

圖8 玉米肽對(duì)ADH激活率隨透析過濾次數(shù)的變化Fig.8 Effect of number of repeated dialysis on of ADH activating activity of CPs

3 討 論

3.1 兩種納濾膜濃縮純化玉米肽液的比較

利用納濾膜技術(shù)分離和純化肽類和氨基酸所依據(jù)的理論基礎(chǔ)主要是Donnan 效應(yīng)和空間位阻效應(yīng)。膜表面通常帶有一定的電荷，離子與靜電膜的電荷相互作用稱為Donnan效應(yīng)。膜的分離選擇性由這兩種效應(yīng)共同決定，其中Donnan效應(yīng)又受溶液的pH值、離子強(qiáng)度、離子組成、多肽、氨基酸濃度以及膜表面電荷密度、電性等因素影響[3]。Pontalier[15]等研究截留分子質(zhì)量為100D和400D兩種聚砜膜的分離機(jī)理，認(rèn)為納濾膜的選擇截留性是幾種不同的物化機(jī)理共同作用的結(jié)果。對(duì)于100D的納濾膜，質(zhì)量傳遞以擴(kuò)散為主；而對(duì)400D納濾膜，則存在兩種分離機(jī)理：即大分子靠表面靜電和位阻的相互作用被截留，而體積小的弱荷電離子則可以進(jìn)入膜孔中靠表面力(靜電力和摩擦力)的作用得以分離。Garem等[4]考察兩種無機(jī)納濾膜對(duì)β-胰蛋白酶酪蛋白水解液所包含的十種多肽的納濾性能，結(jié)果表明離子強(qiáng)度和pH值將對(duì)分離起關(guān)鍵作用。在pH8.0時(shí)，由于分子質(zhì)量較大且負(fù)電荷的多肽分子在膜表面沉積，形成凝膠層，增強(qiáng)了膜表面的負(fù)電性，使在此pH值條件下帶正電的堿性多肽的傳質(zhì)率甚至達(dá)100%，其次為中性多肽，酸性多肽透過率最低。類似的pH12的氨基酸混合溶液，中性和堿性氨基酸傳質(zhì)率較高，酸性氨基酸的傳質(zhì)率則大大降低[16]。據(jù)此推測(cè)，在pH8.0條件下，分子質(zhì)量較大且?guī)ж?fù)電荷的玉米肽會(huì)在膜表面逐步沉積，形成凝膠層，使膜表面帶上負(fù)電荷，而且隨著濃縮過程的不斷進(jìn)行，表現(xiàn)為膜通量的不斷下降(圖1)。對(duì)于160D的納濾膜，空間位阻效應(yīng)起到主要作用，只有極少數(shù)的二肽及大部分的游離氨基酸可以透過膜，表現(xiàn)為對(duì)肽類高的截留率(88.80%)(圖2)，對(duì)氨基酸透過率不及360D膜，且隨VCF的變大，傳質(zhì)率降到只有10.24%(圖3)；而對(duì)于360D的納濾膜，Donnan 效應(yīng)發(fā)揮主導(dǎo)作用，帶有正電荷的小分子堿性的肽類及堿性氨基酸會(huì)首先透過納濾膜，表現(xiàn)為初期較低的肽截留率及較高的氨基酸透過率(圖2、3)。隨著透析的進(jìn)行，Mw＞360D的多肽由于空間位阻效應(yīng)被完全截留，Mw＜360D帶正電荷的多肽及氨基酸逐漸透過膜，而Mw＜360D帶有負(fù)電荷的化合物則由于電負(fù)性膜的排斥作用，很難透過納濾膜。表現(xiàn)為后期較穩(wěn)定的且較高的肽截留率(85.20%以上)(圖 2)。

在制備濃縮玉米蛋白時(shí)的鹽析步驟以及蛋白酶解過程需加入NaOH穩(wěn)定pH值，均會(huì)引入Na+，過高的鹽濃度對(duì)于玉米肽作為一種功能食品來講是不利的。納濾膜對(duì)單價(jià)鹽具有較低的截留率，適用于對(duì)溶液脫鹽[2]。納濾膜對(duì)Na+的傳質(zhì)主要是利用空間位阻效應(yīng)，Na+的直徑要比160D納濾膜孔徑小，易透過膜，但是360D膜的孔徑更大，因此其Na+傳質(zhì)率要高于160D納濾膜(圖4)。經(jīng)過3次透析后，這種差別逐漸被掩蓋，脫鹽率在94%左右，透析5次脫鹽率上升為96%左右，并且由于混合肽液中存在－COO－，會(huì)與Na+以較強(qiáng)的靜電引力結(jié)合，故此條件下Na+并不可能被完全脫除(圖6)。3.2 納濾膜多次透析過濾玉米肽對(duì)其醒酒活性的影響

本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果顯示：玉米肽之所以能夠促進(jìn)酒精代謝和緩解由此引起的肝臟內(nèi)的氧化應(yīng)激，主要是因?yàn)樾》肿淤|(zhì)量的疏水性多肽對(duì)ADH的激活作

用，而玉米肽的抗氧化作用同樣對(duì)緩解氧化應(yīng)激起到協(xié)同作用[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過納濾純化后，玉米肽清除·OH的能力增強(qiáng)了(圖7)，并且隨著透析次數(shù)的增加而提高。但是，玉米肽對(duì)ADH的激活率卻下降了(圖8)。同時(shí)也注意到，與160D納濾后的玉米肽相比，360D納濾膜透析后的產(chǎn)物清除·OH的能力較未純化前提高更多，而對(duì)ADH的激活率卻降低得更多。這提示一些無法透過160D納濾膜，卻可以透過360D納濾膜的二肽、三肽等小分子量的玉米肽可能在激活A(yù)DH的方面起著很重要的作用，這與本室前期得出的“小分子質(zhì)量的疏水性多肽對(duì)ADH起主要激活作用“的結(jié)論是一致的。而分子質(zhì)量較大的玉米肽對(duì)于清除·OH的貢獻(xiàn)更大。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步佐證了筆者以前的結(jié)論[14]：即玉米肽的醒酒作用主要是通過低分子質(zhì)量的疏水性小肽對(duì)ADH的激活作用，而分子量較大的多肽清除·OH能力對(duì)醒酒活性的貢獻(xiàn)是起協(xié)同作用的。

4 結(jié) 論

4.1 在Mw＜5kD玉米肽液濃縮過程中，360D納濾膜對(duì)玉米多肽、氨基酸及Na+均具有較高的傳質(zhì)率。當(dāng)溶液pH值偏離等電點(diǎn)時(shí)，納濾膜對(duì)帶電荷的氨基酸或多肽的截留率發(fā)生明顯變化，Donnan效應(yīng)發(fā)揮主導(dǎo)作用。

4.2 160D納濾膜對(duì)玉米肽的截留率在88.80%以上，脫鹽效果與360D相當(dāng)，多次透析純化仍較好地保持了玉米肽對(duì)ADH的激活作用。綜合考慮玉米肽活性保持、脫鹽及能耗，宜選用160D納濾膜對(duì)玉米肽液進(jìn)行濃縮，透析過濾次數(shù)以3次為宜，脫鹽率達(dá)94.6%。

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Nanofiltration for Concentration and Purification of Corn Peptides and Their Effects on Antialcoholism Activity

YU Guo-cai，HE Hui*，JIN Zhen，HUANG Wen-hao，LI Jiang-tao
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Nanofiltration membranes (NFM) with molecular weight cut off (MWCO) 160 D and 360 D were used to concentrate and purify corn protein hydrolysate of MW < 5 kD at pH 8.0. The mass transfer efficiencies of peptides, amino acids and sodium ion (Na+) in concentration process and the changes in hydroxyl free radical scavenging activity and antialcoholism activity of corn peptides (CPs) in dialysis process were evaluated. The results showed that although 160 NFM exhibited lower transmission/rejection rates of CPs, amino acids and Na+as compared to 360 D NFM, the rejection rate of CPs by 160 D NFM was above 88.80% and it provided desalting effect similar to that of 360 D NFM and yielded a desalting efficiency of 94.6% after triple repeated dialysis. Moreover, the activating effect of corn peptides on alcohol dehydrogenase (ADH) was kept very well in 160 D NFM dialysis. In general, 160 D NFM is suitable to be used for the concentration and purification of corn protein hydrolysate and the number of repeated dialysis should be no more than 3.

nanofiltration (NF)；corn peptides；antialcoholism；dialysis；desalination；alcohol dehydrogenase (ADH)

TS210.9

A

1002-6630(2011)08-0010-05

2010-08-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30972043)；國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2008AA10Z314)

于國(guó)才(1983—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：87283704@163.com

*通信作者：何慧(1960—)，女，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：hehui@mail.hzau.edu.cn