吳燕燕，宮曉靜,2，李來(lái)好，楊賢慶

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

風(fēng)味蛋白酶水解合浦珠母貝肉制備抗菌肽人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法優(yōu)化工藝

吳燕燕1，宮曉靜1,2，李來(lái)好1，楊賢慶1

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

利用具有自學(xué)習(xí)特點(diǎn)的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可實(shí)現(xiàn)對(duì)酶解過(guò)程的模擬仿真，研究從合浦珠母貝肉中制備抗菌肽的最佳工藝條件。采用3層(5-9-3)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法對(duì)風(fēng)味蛋白酶水解合浦珠母貝肉的工藝過(guò)程進(jìn)行模擬和優(yōu)化，并通過(guò)管碟抑菌法對(duì)產(chǎn)物的抑菌性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：pH7.0、水解溫度55℃、酶添加量1.6%、水解時(shí)間4h、料液比7:5，制備得到肽A，抑制鼠傷寒沙門(mén)氏菌最強(qiáng)，抑菌圈直徑14.20mm，平均肽鏈長(zhǎng)度2.6；pH7.0、水解溫度55℃、酶添加量1.7%、水解時(shí)間4h、料液比3:2，制備得到肽B，抑制痢疾志賀氏菌最強(qiáng)，抑菌圈直徑23.42mm，平均肽鏈長(zhǎng)度2.8；pH6.5、水解溫度60℃、酶添加量2.5%、水解時(shí)間4h、料液比7:5，制備得到肽C，對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑制效果最強(qiáng)，抑菌圈直徑16.60mm，平均肽鏈長(zhǎng)度2.5。3種抗菌肽對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌也具有較強(qiáng)的抑菌效果，抑菌率為74.3%～80.8%。本研究利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化制備的貝肉抗菌肽克服了純度低、提取率低等缺點(diǎn)，為合浦珠母貝肉抗菌肽的開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

合浦珠母貝肉；抗菌肽；制備；人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化法

由于當(dāng)前食品工業(yè)上所采用的防腐保鮮劑多為化學(xué)合成，從更安全和健康的角度出發(fā)，亟需尋找天然高效的食品防腐保鮮劑。抗菌肽由于具有廣譜抗菌的特點(diǎn)，從天然產(chǎn)物中獲取天然抗菌肽應(yīng)用于食品防腐保鮮是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，合浦珠母貝(Pinctada fucata)是我國(guó)生產(chǎn)海水珍珠主要養(yǎng)殖貝類(lèi)，隨著海水珍珠養(yǎng)殖產(chǎn)量的不斷增大，采珠后產(chǎn)生的大量珍珠貝肉急需進(jìn)行高值化加工利用。由于珍珠貝類(lèi)本身缺乏類(lèi)似高等脊椎動(dòng)物那樣的特異免疫系統(tǒng)，其免疫主要依賴于豐富的體液防御系統(tǒng)中的各類(lèi)免疫因子，其非特異性免疫系統(tǒng)很發(fā)達(dá)，而抗菌肽是其非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，且其生長(zhǎng)過(guò)程生產(chǎn)珍珠的特異性，因此蘊(yùn)藏著豐富的抗菌肽。由于海洋環(huán)境的復(fù)雜性和多樣性，海洋無(wú)脊椎動(dòng)物抗菌肽具有比陸生生物抗菌肽抗菌活性更強(qiáng)、更耐熱、更耐鹽等特性，因而其在食品保鮮、貯藏及加工上的應(yīng)用具有更廣闊的前景。

控制酶解過(guò)程制備抗菌肽屬于非線性和非穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)，傳統(tǒng)的正交試驗(yàn)分析方法對(duì)因素水平和交互作用的要求有一定的限制，不可避免地要損失一些信息，不能真正獲得多因素連續(xù)區(qū)域中的最優(yōu)工藝方案。而具有高度的非線性、能夠進(jìn)行復(fù)雜的邏輯操作和非線性關(guān)系實(shí)現(xiàn)的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化法則因其獨(dú)特的并行性、容錯(cuò)性、自學(xué)習(xí)性及強(qiáng)大的運(yùn)算、識(shí)別、判斷能力適合對(duì)此過(guò)程的建模及仿真。目前人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)已用于包括干燥、焙烤、擠壓、發(fā)酵、采后保藏、食品流變學(xué)及熱處理等食品工業(yè)領(lǐng)域[1]。本實(shí)驗(yàn)以合浦珠母貝肉為原料，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)為指標(biāo)，設(shè)計(jì)了3層人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)酶解過(guò)程進(jìn)行模擬和仿真，利用24組試驗(yàn)結(jié)果為訓(xùn)練樣本，充分挖掘試驗(yàn)信息，從而獲得制備合浦珠母貝肉抗菌肽的最優(yōu)酶解工藝條件，為合浦珠母貝肉的高值化利用提供新的技術(shù)。而從珍珠貝肉中制備的海洋天然抗菌肽也將為食品工業(yè)提供抑菌效果更佳的天然防腐保鮮劑，具有較大的應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

合浦珠母貝肉：購(gòu)于海南珍珠貝養(yǎng)殖場(chǎng)，－20℃冷凍備用。

風(fēng)味蛋白酶(20萬(wàn)U/g，食品級(jí)) 丹麥Novo公司；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

供試病原菌：鼠傷寒沙門(mén)氏菌(S a l m o n e l l a typhimurium)、痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach) 廣東省微生物菌種保藏中心。

1.2 儀器與設(shè)備

KjeltecTM2300全自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥Foss公司；3K30型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；BS124S型電子天平、普及型pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司；DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；DK-S24型恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；全自動(dòng)菌落分析儀 杭州迅數(shù)科技有限公司；Akku-drive電子滴定儀 德國(guó)赫施曼公司。

1.3 方法

1.3.1 合浦珠母貝肉水解液制備

新鮮貝肉預(yù)處理→組織搗碎→酶解→滅酶→離心→超濾→貝肉水解液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌種活化

在無(wú)菌條件下，將菌種接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的試管斜面上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

1.3.3 菌懸液配制

用接種環(huán)從活化后的菌種斜面上刮少量菌，在100mL無(wú)菌生理鹽水中稀釋，振搖均勻，即為濃度1；然后從濃度1的試管中準(zhǔn)確吸取1mL，加入到裝有9mL無(wú)菌生理鹽水的試管里混勻，即為濃度2；同濃度2法得到濃度3，備用。

1.3.4 管碟法測(cè)抑菌圈直徑[2]

培養(yǎng)基應(yīng)預(yù)先滅菌并冷卻至40～50℃，從濃度3的試管里準(zhǔn)確吸取0.2mL菌懸液，對(duì)號(hào)放入已編好號(hào)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中(每種菌做3個(gè)重復(fù))，將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中(約10～15mL)，迅速輕輕搖勻，水平位置靜置30min，使培養(yǎng)基冷凝，制成帶菌平板，每個(gè)平板上放3個(gè)牛津杯(內(nèi)徑6mm、外徑8mm、高10mm的不銹鋼杯)，每管加入貝肉酶解液0.2mL，以蒸餾水作為對(duì)照(CK)，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，用全自動(dòng)菌落分析儀測(cè)其抑菌圈直徑。

1.3.5 水解度(degree of hydrolysis，DH)及平均肽鏈長(zhǎng)度(peptide chain length，PCL)的測(cè)定

蛋白氮含量采用凱氏定氮法[3]；氨基氮含量采用甲醛滴定法[4]。

式中：N1為水解液中氨基氮含量；N2為原料中粗蛋白氮含量。

1.3.6 單因素試驗(yàn)

1.3.6.1 料液比對(duì)抑菌圈直徑的影響

將貝肉在pH7.0、水浴溫度55℃條件下，調(diào)節(jié)不同的料液比(g/mL)，即3:1、3:2、3:3、3:4、3:5、3:6，以酶添加量為2.0%加酶后水解相同3h，測(cè)定各組水解液的抑菌圈直徑。

1.3.6.2 水解時(shí)間對(duì)抑菌圈直徑的影響

其他條件同1.3.6.1節(jié)，在料液比3:2條件下，調(diào)節(jié)不同的水解時(shí)間，即2、3、4、5、6、7 h處理貝肉，測(cè)定各組水解液的抑菌圈直徑。

1.3.6.3 酶添加量對(duì)抑菌圈直徑的影響

其他條件同1.3.6.1節(jié)，在料液比3:2條件下，調(diào)節(jié)不同的酶添加量，即1.2%、1.6%、2.0%、2.4%、2.8%、3.2%的比例加酶后水解相同3h，測(cè)定各組水解液的抑菌圈直徑。

1.3.6.4 pH值對(duì)抑菌圈直徑的影響

其他條件同1.3.6.1節(jié)，在料液比3:2的條件下，調(diào)節(jié)不同的pH值，即pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5條件下保溫30min，加酶后將貝肉水解相同3h，測(cè)定各組水解液的抑菌圈直徑。

1.3.6.5 水解溫度對(duì)抑菌圈直徑的影響

其他條件同1.3.6.1節(jié)，在料液比3:2條件下，調(diào)節(jié)不同的水浴溫度，即40、45、50、55、60、65℃的水溫水解相同3h，測(cè)定各組水解液的抑菌圈直徑。

1.3.7 抗菌肽制備條件的優(yōu)化試驗(yàn)

利用Matlab軟件以人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)工具箱進(jìn)行編程，選用5個(gè)輸入神經(jīng)元、隱含層含9個(gè)神經(jīng)元和3個(gè)輸出神經(jīng)元的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化風(fēng)味蛋白酶水解合浦珠母貝肉工藝。設(shè)定pH值、水解溫度、酶添加量、水解時(shí)間、料液比5個(gè)酶解工藝參數(shù)，并以貝肉水解液分別對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌、痢疾志賀氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌圈效果作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行制備條件的優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

采用Matlab2009a和Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)抑菌圈直徑的影響

圖1 料液比對(duì)抑菌圈直徑的影響Fig.1 Effect of ratio of material to liquid on inhibitory zone diameters against three bacterial species

由圖1可見(jiàn)，料液比對(duì)產(chǎn)物的抑菌活性影響顯著，在料液比3:2～3:5范圍內(nèi)，抑菌活性較強(qiáng)，當(dāng)料液比為3:3時(shí)，水解液的抑菌活性最高，對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌、痢疾志賀氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌圈直徑分別為11.03、14.32、12.89mm。說(shuō)明水在一定程度上能疏松貝肉漿液的致密組織，增大酶與底物的接觸面積，對(duì)提取起到良好的效果，但水用量過(guò)高，底物濃度降低，對(duì)酶與底物的反應(yīng)速度有較大影響，單位時(shí)間內(nèi)貝肉抗菌肽的提取率隨之降低，因此應(yīng)當(dāng)選擇合適的料液比。

2.1.2 水解時(shí)間對(duì)抑菌圈直徑的影響

圖2 水解時(shí)間對(duì)抑菌圈直徑的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on inhibitory zone diameters against three bacterial species

由圖2可見(jiàn)，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物的抑菌活性先增加后減少，在水解時(shí)間3～6h范圍內(nèi)，產(chǎn)物對(duì)3種菌的抑菌活性較強(qiáng)。而水解時(shí)間大于6h，酶解產(chǎn)物進(jìn)一步降解形成其他類(lèi)型的短肽和氨基酸，就得不到具有抑菌特性肽，所以需要在3～6h水解時(shí)間中進(jìn)一步篩選出最佳的的水解時(shí)間，既能節(jié)約能源，也能得到抑菌活性較高的貝肉抗菌肽提取物。

圖3 酶添加量對(duì)抑菌圈直徑的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on inhibitory zone diameters against three bacterial species

2.1.3 酶添加量對(duì)抑菌圈直徑的影響由圖3可見(jiàn)，酶添加量對(duì)產(chǎn)物的抑菌活性影響較顯著，當(dāng)?shù)孜餄舛炔蛔儯黾用柑砑恿?，則催化反應(yīng)速

度增大，單位時(shí)間所生成的產(chǎn)物增加，因此單位時(shí)間

內(nèi)產(chǎn)物的抑菌活性增強(qiáng)，當(dāng)酶添加量為1.6%～2.4%范圍內(nèi)，得到的肽對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌、痢疾志賀氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌效果最強(qiáng)，而酶的添加量大于2.4%后，產(chǎn)物的抑菌活性基本趨于穩(wěn)定。

2.1.4 pH值對(duì)抑菌圈直徑的影響

圖4 pH值對(duì)抑菌圈直徑的影響Fig.4 Effect of pH on inhibitory zone diameters against three bacterial species

由圖4可見(jiàn)，酶解過(guò)程pH值對(duì)產(chǎn)物的抑菌活性有影響，在pH6.5～8.0范圍內(nèi)時(shí)，表現(xiàn)較強(qiáng)的抑菌活性。pH值對(duì)產(chǎn)物的抑菌活性的影響程度主要取決于其對(duì)風(fēng)味蛋白酶酶活的影響程度，在pH6.5～8.0范圍內(nèi)，風(fēng)味蛋白酶的酶活最高，因此其酶解產(chǎn)物的抑菌活性也最強(qiáng)。

2.1.5 水解溫度對(duì)抑菌圈直徑的影響

由圖5可見(jiàn)，隨著水解溫度的增大，產(chǎn)物的抑菌活性先增加后降低，當(dāng)溫度在45～60℃范圍內(nèi)，表現(xiàn)較強(qiáng)的抑菌活性。當(dāng)溫度在55℃，水解產(chǎn)物對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌、和單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑分別為11.89mm、12.98mm；當(dāng)溫度在50℃時(shí)，水解產(chǎn)物對(duì)痢疾志賀氏菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑為12.88mm。

圖5 水解溫度對(duì)抑菌圈直徑的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on inhibitory zone diameters against three bacterial species

2.2 抗菌肽制備條件優(yōu)化

2.2.1 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)試驗(yàn)結(jié)果分析與優(yōu)化

圖6 鼠傷寒沙門(mén)氏菌(A)、痢疾志賀氏菌(B)和單核細(xì)胞增生李斯特菌(C)的抑菌圈直徑的誤差Fig.6 Errors between ANN predictions and experimental results of inhibitory zone diameters against three bacterial species

根據(jù)單因素試驗(yàn)的初步結(jié)果，利用Matlab軟件以人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)工具箱為依據(jù)，進(jìn)行人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)，優(yōu)化風(fēng)味蛋白酶水解合浦珠母貝肉工藝，各試驗(yàn)組的編碼與取值見(jiàn)表1，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練樣本為24個(gè)，采用快速反向傳播算法，設(shè)定目標(biāo)訓(xùn)練均方差為10-5，學(xué)習(xí)速率為0.03，完成訓(xùn)練擬合步數(shù)＜500步，組成訓(xùn)練集對(duì)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練，使之誤差達(dá)到滿意的程度。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果的比較見(jiàn)表2，產(chǎn)物的實(shí)際抑菌效果與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)抑菌效果的差異見(jiàn)網(wǎng)絡(luò)圖6。

表1 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)樣本輸入與輸出Table 1 Input and output data for ANN training samples

表2 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)測(cè)結(jié)果比較Table 2 Comparasion between ANN predictions and experimental results

由表2及圖6可知，經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有較好的預(yù)測(cè)能力，預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際結(jié)果的誤差都在± 10%以內(nèi)，說(shuō)明該網(wǎng)絡(luò)擬合度良好，可用此網(wǎng)絡(luò)來(lái)優(yōu)化風(fēng)味蛋白酶對(duì)合浦珠母貝肉的整個(gè)酶解過(guò)程。

經(jīng)該人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)：當(dāng)pH7.0、水解溫度55℃、酶添加量1.6%、水解時(shí)間4h、料液比7:5，酶解液(肽A)對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抑菌活性最高，最大抑菌圈直徑為15.27mm；當(dāng)pH7.0、水解溫度55℃、酶添加量1.7%、水解時(shí)間4h、料液比3:2，酶解液(肽B)對(duì)痢疾志賀氏菌的抑菌活性最高，最大抑菌圈直徑為23.53mm；當(dāng)pH6.5、水解溫度60℃、酶添加量2.5%、水解時(shí)間4h、料液比7:5，酶解液(肽C)對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌活性最高，最大抑菌圈直徑為16.37mm。

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

表3 最佳工藝條件下制備的抗菌肽抑菌性分析Table 3 Antimicrobial activities of three peptide products obtained under optimzed hydrolysis condiitons

按以上人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)所得預(yù)測(cè)值，即在最優(yōu)水解參數(shù)條件下進(jìn)行3個(gè)平行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證肽A對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抑菌圈直徑為14.20mm；肽B對(duì)痢疾志賀氏菌的抑菌圈直徑為23.42mm；肽C對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌圈直徑為16.60mm，試驗(yàn)所得實(shí)際結(jié)果與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)結(jié)果的誤差均在±10%以內(nèi)，證明人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法具有較好的預(yù)測(cè)性，對(duì)風(fēng)味蛋白酶酶解制備合浦珠母貝肉抗菌肽的工藝條件具有指導(dǎo)意義。

將利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化貝肉酶解工藝得到的3種抗菌肽應(yīng)用于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3，3種抗菌肽對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑菌效果，其抑菌率大小與其對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌、痢疾志賀氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌率大小基本相似，為74.3%～80.8%。綜上可證明，合浦珠母貝肉抗菌肽具有抑菌活性高、抗菌廣等特點(diǎn)，同時(shí)，利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化制備的貝肉抗菌肽克服了純度低、提取率低等缺點(diǎn)，為創(chuàng)造可觀的合浦珠母貝肉抗菌肽的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

3 討 論

抗菌肽類(lèi)防腐劑由于其安全無(wú)毒害、甚至對(duì)人體有保健作用而受到人們的廣泛關(guān)注[7-8]?？咕某哂锌咕饔猛?，還具有抗病毒、抗腫瘤和抗癌活性，抗菌肽不易導(dǎo)致耐藥性，并且對(duì)生物體本身無(wú)害，符合人類(lèi)食品安全的要求，因此使得抗菌肽的研究意義越來(lái)越重要[9-11]。在抗菌肽研究中，許多學(xué)者都用正交試驗(yàn)優(yōu)化制備抗菌肽，宋宏霞等[12]用正交試驗(yàn)優(yōu)化制備紫貽貝抗菌肽，金莉莉等[13]用正交試驗(yàn)優(yōu)化制備林蛙皮抗菌肽，用正交試驗(yàn)優(yōu)化制備的抗菌肽對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等致病菌的抑菌圈直徑都在10～15mm范圍內(nèi)，抑菌性相對(duì)不明顯。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化制備抗菌肽，由于其推廣、概括能力較強(qiáng)，克服了正交試驗(yàn)只能在已定的水平、一定的實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)優(yōu)化的缺陷，因此，可以大大提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。另外，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化法具有更高度的非線性和更強(qiáng)大的運(yùn)算能力，能準(zhǔn)確的運(yùn)算和統(tǒng)計(jì)大量的數(shù)據(jù)，因此可以大大增加試驗(yàn)結(jié)果的精確性[14-15]。

通過(guò)單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)料液比和酶添加量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著，而水解時(shí)間、pH值、水解溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著，說(shuō)明酶與底物的充分接觸和酶濃度是整個(gè)酶解過(guò)程的關(guān)鍵參數(shù)。由于風(fēng)味蛋白酶是粉末，直接與貝肉漿液混合達(dá)不到良好的酶解效果，而料水混合的過(guò)程是將貝肉漿液稀釋的過(guò)程，加酶后，酶很快溶于稀釋液中，增大了酶與底物的接觸面積，使酶與底物很好的結(jié)合，達(dá)到理想的酶解效果。另外，在酶促反應(yīng)中，當(dāng)?shù)孜餄舛却蟠蟪^(guò)酶濃度，使酶被底物飽和時(shí)，反應(yīng)速度與酶濃度成正比關(guān)系，酶濃度越高，反應(yīng)速度越快，酶解效果越好，當(dāng)酶底比達(dá)到最佳濃度時(shí)，酶解效果達(dá)到最佳，并隨酶濃度的增加而保持平衡。

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化制備合浦珠母貝肉抗菌肽，根據(jù)管碟抑菌法測(cè)定結(jié)果表明，其對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌、痢疾志賀氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等細(xì)菌具有較強(qiáng)的抑菌效果，大腸桿菌的抑菌圈直徑20.9mm、對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑18.3mm，相比宋宏霞等[12]正交優(yōu)化后的紫貽貝抗菌肽對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑9.8mm、對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑12.5mm，及王輝等[16]正交優(yōu)化后的牙鲆抗菌肽對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑14mm、對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑12mm，本方法更高效，更精確，更經(jīng)濟(jì)。

本研究利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化得到風(fēng)味蛋白酶水解合浦珠母貝肉制備抗菌肽的最佳工藝條件：pH7.0、水解溫度55℃、酶添加量1.6%、水解時(shí)間4h、料液比7:5，制備得到肽A，平均肽鏈長(zhǎng)度為2.6，抑制鼠傷寒沙門(mén)氏菌能力最強(qiáng)；pH7.0、水解溫度55℃、酶添加量1.7%、水解時(shí)間4h、料液比3:2，制備得到肽B，平均肽鏈長(zhǎng)度為2.8，抑制痢疾志賀氏菌能力最強(qiáng)；pH6.5、水解溫度60℃、酶添加量2.5%、水解時(shí)間4h、料液比7:5，制備得到肽C，平均肽鏈長(zhǎng)度為2.5，對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑制效果最強(qiáng)。抑菌試驗(yàn)證明3種抗菌肽對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌、痢疾志賀氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等細(xì)菌均具有較強(qiáng)的抑菌效果，抑菌率為70.2%～83.9%，其中，肽B的抑菌活性最高，其對(duì)5種細(xì)菌的抑菌率達(dá)到75%以上，并且對(duì)痢疾志賀氏菌的抑制效果最強(qiáng)，抑菌率達(dá)到83.9%。該研究為合浦珠母貝肉抗菌肽的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，并且為今后肽B的抗菌譜試驗(yàn)、分離純化及結(jié)構(gòu)分析等研究提供了可靠的依據(jù)。

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Process Optimization for Preparation of Antimicrobial Peptides fromPinctada fucataMuscle by Flavourzyme Hydrolysis Using Artificial Production Neural Network

WU Yan-yan1，GONG Xiao-jing1,2，LI Lai-hao1，YANG Xian-qing1
(1. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, National Research and Development Center for Aquatic Product Processing, Guangzhou 510300, China；
2. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

In this paper, artificial neural network (ANN), which can simulate an enzymatic hydrolysis process based on selflearning, was applied to study the optimum conditions for enzymatic preparation of antibacterial peptides fromPinctada fucatamuscle with flavourzyme. The hydrolysis ofPinctada fucatamuscle by flavourzyme was simulated and optimized using a threehierarchy ANN structure. The antimicrobial activity ofPinctada fucatamuscle hydrolysates was tested by cylinder-plate method. The results demonstrated that the peptide A was obtained after 4 h of hydrolysis under the conditions of pH 7.0, 55 ℃, 7:5 material/liquid ratio and 1.6% enzyme/substrate ratio, which showed the strongest antibacterial activity againstSalmonella typhimuriumwith an inhibition zone diameter of 14.20 mm and an average peptide chain length of 2.6. Four-hour hydrolysis under the conditions of pH 7.0, 55 ℃, 3:2 material/liquid ratio and 1.7% enzyme/substrate ratio generated the peptide B, which had the strongest antibacterial activity againstShigella dysenteriaewith an inhibition zone diameter of 23.42 mm and an average peptide chain length of 2.8. The peptide C was obtained under the conditions of pH 6.5, 60 ℃, 7:5 material/liquid ratio, 2.5% enzyme/ substrate ratio and 4 h hydrolysis, which displayed the strongest antibacterial activity againstL.monocytogeneswith an inhibition zone diameter of 16.60 mm and an average peptide chain length of 2.5. The three peptides also had strong antibacterial activity againstEscherichia coliandStaphyloccocus aureuswith an inhibitory rate ranged of 74.3%－80.8%. The applicationof ANN for optimizing antibacterial peptides preparation fromPinctada fucatamuscle overcomes many shortcomings such as low purity and low extraction efficiency and can therefore provide technical supports for the development and exploitation of antibacterial peptides derived fromPinctada fucatamuscle.

Pinctada fucatamuscle；antimicrobial peptides；production；artificial neural network optimization

2011-06-22

海南省重點(diǎn)科技項(xiàng)目(070121；ZDXM20100005)

吳燕燕(1969—)，女，研究員，博士，主要從事水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全研究。E-mail：wuyy1028@yahoo.com.cn

TS254.1

A

1002-6630(2011)20-0063-06