林 燕，王鴻飛，李和生，劉 飛，毛方華

(寧波大學(xué)生物工程與生命科學(xué)學(xué)院，浙江寧波315211)

酶法水解魷魚皮制備多肽工藝的研究

林 燕，王鴻飛*，李和生，劉 飛，毛方華

(寧波大學(xué)生物工程與生命科學(xué)學(xué)院，浙江寧波315211)

分析了阿根廷魷魚皮的一般化學(xué)組成，并以其為原料，研究了酶的種類、加酶量、pH、溫度及酶解時(shí)間對(duì)水解度(DH)的影響。采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)酶解工藝進(jìn)行了優(yōu)化，研究結(jié)果表明，復(fù)合蛋白酶水解魷魚皮制備多肽工藝的最適條件為:加酶量14000u/g、pH8.5、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間4h。在此條件下水解度可達(dá)20.7%。

魷魚皮，酶解工藝，優(yōu)化

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魷魚 阿根廷魷魚，購(gòu)自寧波江東水產(chǎn)市場(chǎng)，重量150～200g;木瓜蛋白酶(測(cè)定活力6.32×104U/g)、堿性蛋白酶(測(cè)定活力19.21×104U/g)、胃蛋白酶(測(cè)定活力3.56×104U/g) 上海楷洋生物工程有限公司;中性蛋白酶(13.08×104U/g) 廣西南寧龐博生物工程有限公司;復(fù)合蛋白酶(測(cè)定活力12.97× 104U/g) 廣州友志貿(mào)易有限公司;牛血紅蛋白(BR) 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;其他試劑 均為分析純。

Cary-50紫外分光光度計(jì) 美國(guó)VARIAN公司; T6-新悅可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;WK-200B高效藥物粉碎機(jī) 山東精誠(chéng)機(jī)械有限公司;CS101-1AB電熱鼓風(fēng)干燥箱 重慶銀河實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;KDN-04消化爐 上海新嘉電子有限公司;SX2-4-10馬弗爐 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申順生物科技有限公司;DK-S22電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;PB-10pH計(jì)、BP-211D電子天平 德國(guó)sartorius公司;SZCL型數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器鞏義市中博儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 魷魚皮粉→溶解→加酶酶解→滅酶→冷卻→多肽液

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 原料前處理 魷魚皮剪成小塊置于鐵絲網(wǎng)上，于50℃下鼓風(fēng)烘干12～15h，最終水分含量控制在4.5%～5%，經(jīng)高效藥物粉碎機(jī)粉碎(1min/批)，得魷魚皮粉，密封于干燥器中，待用。

1.2.2.2 酶解 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定底物濃度為4%。稱取一定量魷魚皮粉，溶解使底物濃度為4%，根據(jù)底物質(zhì)量加酶，振蕩混勻后在一定條件下酶解，酶解完成后沸水浴滅酶10min，冷卻定容并進(jìn)行水解度的測(cè)定。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 蛋白酶的選擇 選取木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶，根據(jù)其活力選擇不同的添加量，在各自最適的酶解條件下進(jìn)行酶解，以水解度為指標(biāo)確定最適的水解用酶。

1.2.3.2 加酶量的選擇 每克底物分別添加8000、10000、12000、14000、16000、18000u的酶量，在pH6.5、溫度45℃的條件下酶解4h，然后測(cè)定水解度，綜合選定最適酶用量。

1.2.3.3 pH的選擇 分別調(diào)節(jié)酶解體系pH為7.0、8.0、8.5、9.0、9.5，在45℃條件下酶解4h，測(cè)定水解度并確定最適pH。

1.2.3.4 溫度的選擇 在前面確定的最適條件下分別在40、45、50、55、60℃條件下酶解4h，確定最適酶解溫度。

1.2.3.5 酶解時(shí)間的選擇 對(duì)于選定的最適水解用酶，在相同的水解條件下酶解2、3、4、5、6h以確定最適酶解時(shí)間。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，其因素與水平見表1，按L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.5 測(cè)定方法

1.2.5.1 基本成分測(cè)定 總氮含量測(cè)定:凱氏定氮法(GB/T 5009.5-2003);水分含量測(cè)定:直接干燥法(GB/T 5009.3-2003);灰分含量測(cè)定:灼燒重量法(GB 5009.4-85);脂肪含量測(cè)定:索氏抽提法(GB/T 14772-2008)。

1.2.5.2 酶活力測(cè)定 福林-酚法。其中，木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶按SB/T 10317-1999測(cè)定;胃蛋白酶按中國(guó)藥典2000版(第二部)測(cè)定。

1.2.5.3 水解度(DH)測(cè)定［14］甲醛電位滴定法。以游離氨基氮占總氨基氮的含量表示水解度，其公式為DH(%)=游離氨基酸氮總量/總氨基氮×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 魷魚皮的基本成分

魷魚皮的基本成分見表2。魷魚皮中含有大量水分，其干物質(zhì)主要成分是蛋白質(zhì)。通過測(cè)定其粗蛋白含量為73.9%(以干基重計(jì))。

表2 魷魚皮的一般化學(xué)組成(濕基)

2.2 蛋白酶的選擇

分別在每一種酶的適宜條件下進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 不同酶的酶解效果酶種類 溫度(℃) pH 水解度DH(%)

從表3可以看出，各種酶的水解程度為:復(fù)合蛋白酶＞中性蛋白酶＞胃蛋白酶＞堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶，其中復(fù)合蛋白酶的水解程度明顯高于其余四種酶，木瓜酶水解度較低。因此，選用復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解工藝的水解用酶。

2.3 酶量對(duì)水解度的影響

根據(jù)選酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取復(fù)合蛋白酶進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在pH6.5、溫度45℃、酶解時(shí)間4h的條件下，研究不同酶量對(duì)水解度的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 復(fù)合蛋白酶加酶量對(duì)水解度的影響

由圖1可知，當(dāng)復(fù)合酶量小于14000u/g時(shí)，隨著酶量的增加，水解度不斷升高;當(dāng)復(fù)合酶量大于14000u/g后，水解度基本保持不變。

在酶法制取魷魚皮多肽時(shí)，酶的用量對(duì)魷魚皮蛋白的水解程度有顯著的影響。一般地，隨酶用量的增加水解程度也隨之增加;但當(dāng)水解到一定程度時(shí)，隨底物濃度的下降、酶量的增加，水解度再不會(huì)提高。由圖1表明，較小酶用量14000u/g時(shí)，就可達(dá)到較好的水解效果。

2.4 pH對(duì)水解度的影響

在加酶量14000u/g、溫度45℃、酶解時(shí)間4h的條件下，研究不同pH對(duì)水解度的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 pH對(duì)水解度的影響

由圖2可知，酶解體系的pH對(duì)酶解效果有顯著的影響。因?yàn)閜H的大小直接影響酶的活力，每一種酶都有其適宜的pH范圍。當(dāng)pH小于8.5時(shí)，隨pH的升高水解度增加;當(dāng)pH大于8.5時(shí)，隨pH的升高水解度降低;pH8.5時(shí)，水解度最高。表明復(fù)合蛋白酶在pH8.5時(shí)的弱堿性條件下對(duì)魷魚皮蛋白的水解達(dá)到了一個(gè)較好的效果，在過酸或過堿的環(huán)境下，復(fù)合蛋白酶的活性會(huì)受到不同程度的抑制，此外，不適宜的pH環(huán)境還會(huì)影響酶與其底物的結(jié)合，也會(huì)影響水解效果。

2.5 溫度對(duì)水解度的影響

在加酶量14000u/g、pH8.5、酶解時(shí)間4h的條件下，研究不同溫度對(duì)水解度的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對(duì)水解度的影響

由圖3可知，溫度對(duì)酶解效果有較顯著的影響。不但影響水解反應(yīng)，而且影響酶的活力。當(dāng)溫度低于50℃時(shí)，隨溫度的增加水解程度增高;當(dāng)大于50℃時(shí)，水解度有所降低;在50℃時(shí)，有較高的水解度。在用復(fù)合蛋白酶水解魷魚皮蛋白時(shí)，可選用溫度50℃作為水解溫度。

2.6 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

在加酶量14000u/g、pH8.5、溫度50℃的條件下，研究不同酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響，結(jié)果見圖4。

一般地，隨著作用時(shí)間的增加，水解度不斷增加;但當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間后，隨底物濃度的下降、水解產(chǎn)物的積累，水解度增加的程度變得不明顯，為提高經(jīng)濟(jì)效益，此時(shí)為酶解最少的作用時(shí)間。由圖4表明，在酶作用時(shí)間4h以下時(shí)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度增高;當(dāng)4h以后，水解度基本保持不變;在用復(fù)合蛋白酶水解魷魚皮蛋白時(shí)，可選用4h為酶解時(shí)間。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

2.7 酶解工藝條件的優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，按L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見表4。

表4 復(fù)合蛋白酶水解魷魚皮正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析

由極差分析(R值)可得，四個(gè)因素對(duì)復(fù)合蛋白酶水解度的影響依次為:B＞C＞A＞D，優(yōu)化所得條件為:B2C2A3D2，即 pH8.5、溫度 50℃、加酶量18000u/g、時(shí)間4h。但從極差分析的三個(gè)平均值(K值)來看，加酶量的后兩個(gè)水平相差很小，也就是說增加4000u的酶量對(duì)其水解度的影響幾乎可忽略不計(jì)，從經(jīng)濟(jì)上考慮，仍然選擇14000u/g作為復(fù)合酶水解工藝的最適加酶量，在此條件下酶解魷魚皮所得水解度為20.7%。

3 結(jié)論

對(duì)阿根廷魷魚皮的一般組成進(jìn)行了測(cè)定并對(duì)其酶解工藝進(jìn)行了研究。通過酶的選擇，確定了復(fù)合蛋白酶作為適合的魷魚皮制取多肽用酶。通過單因素及正交實(shí)驗(yàn)，研究表明，復(fù)合蛋白酶酶解魷魚皮的最適工藝條件為:pH8.5、溫度50℃、加酶量14000u/g(干基)、水解時(shí)間4h，在此條件下能得到較高的水解度。

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Study on the enzymatic hydrolysis technology of squid skin(Illex argentinus)peptides

LIN Yan，WANG Hong-fei*，LI He-sheng，LIU Fei，MAO Fang-hua
(College of Bioengineering and Life Science，Ningbo University，Ningbo 315211，China)

General chemical composition of squid skin(Illex argentinus)were analyzed.The effects such as enzyme kind，protease dose，pH，hydrolysis temperature and hydrolysis time on degree of hydrolysis(DH)of squid skin were investigated.The enzyme hydrolysis technology condition was optimized by orthogonal testing.The results showed that the feasible enzyme hydrolysis technology conditions were that the protamex protease dose 14000u/g，pH8.5，hydrolysis temperature 50℃and hydrolysis time 4h，from which the hydrolyzed degree of the squid skin was 20.7%.

squid skin;enzymolysis technology;optimization

TS254.1

A

1002-0306(2011)03-0204-04

近年來，隨著我國(guó)遠(yuǎn)洋魷釣業(yè)的迅速發(fā)展，魷魚日益成為我國(guó)主要的海洋經(jīng)濟(jì)軟體動(dòng)物和水產(chǎn)品加工原料，僅2005年我國(guó)魷魚捕獲量就達(dá)40～50t。目前，我國(guó)魷魚加工利用技術(shù)含量較低，生產(chǎn)中產(chǎn)生的頭、內(nèi)臟、皮等大多都被作為廢棄物丟棄、掩埋，不但造成了資源的浪費(fèi)，而且還污染了環(huán)境。因此，如何加工利用這些廢棄物，提高漁業(yè)的附加值，增加漁民的收入，就成為亟待解決的熱點(diǎn)問題。對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物皮的價(jià)值以及利用在國(guó)內(nèi)外都已有不少研究報(bào)道。無論是在魚皮制革［1-2］、作為蛋白質(zhì)新資源［3-7］還是其他生物活性物質(zhì)提取與利用等［8-10］方面，都顯示出水產(chǎn)動(dòng)物皮的誘人經(jīng)濟(jì)價(jià)值與前景。魷魚皮的膠原蛋白含量較高，約占干重的80%［11］。據(jù)報(bào)道，膠原多肽的吸收率幾乎達(dá)100%，且具有抗?jié)?、降血壓、促進(jìn) Ca2+吸收等多種生物學(xué)活性［12］。B.Giménez等［6］通過對(duì)魷魚皮多肽的抗氧化性及其他理化性質(zhì)的研究，表明其對(duì)Fe2+的螯合能力、ABTS自由基的清除能力等有顯著的效果。Eresha Mendi等［13］也對(duì)秘魯魷魚皮明膠多肽進(jìn)行了體外抗氧化性的研究，發(fā)現(xiàn)其水解物本身就已經(jīng)顯示出了很強(qiáng)的甚至比天然抗氧化劑維生素E還要高很多的脂質(zhì)抗氧化能力，此外其研究小組還分離出了兩種具有強(qiáng)抗氧化能力的小肽并對(duì)其序列進(jìn)行了測(cè)定。對(duì)于多肽的獲取或蛋白質(zhì)的利用，酶解工藝相對(duì)于其它工藝來講具有簡(jiǎn)單、安全、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)而被廣泛采用。本文以魷魚皮為原料，采用酶法水解工藝，對(duì)酶進(jìn)行選擇，通過單因素與正交實(shí)驗(yàn)確定酶解的適宜條件，以期制取魷魚皮多肽，為魷魚皮多肽的加工提供理論基礎(chǔ)及工藝參數(shù)。

2010-03-25 *通訊聯(lián)系人

林燕(1986-)，女，碩士研究生，研究方向:食品科學(xué)。

浙江省科技廳(2009C03017-3);寧波大學(xué)科研基金(xkl123)。