蘇東海，胡麗花，蘇東民，*，辛秀蘭

(1.北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)系，北京100029;2.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450052)

酵母菌和乳酸菌發(fā)酵老面團過程中對可溶性糖的代謝

蘇東海1，胡麗花2，蘇東民2，*，辛秀蘭1

(1.北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)系，北京100029;2.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450052)

采用Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.0562和/或Lactobacillus brevis CGMCC 1.0579純菌接種發(fā)酵老面團，研究老面團發(fā)酵過程中微生物對可溶性糖的代謝作用。本實驗確定了高效液相色譜(HPLC)-蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)檢測老面團中可溶性糖(麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖)的方法為流動相乙腈/水(70∶30，V/V)，流速1.0mL/min，柱溫25℃;ELSD漂移管溫度83.5℃，載氣空氣流速2.2L/min。結(jié)果顯示，S.cerevisiae 2.0562能快速消耗麥芽糖、蔗糖和葡萄糖，對果糖的消耗較慢;接種單一L.brevis 1.0579時，麥芽糖、葡萄糖的濃度增大，總體而言蔗糖濃度呈下降趨勢，果糖呈上升趨勢;接種S.cerevisiae 2.0562和L.brevis 1.0579時，麥芽糖、葡萄糖和果糖的濃度前幾個小時降低，隨后開始增加，而乳酸菌的存在減慢了酵母菌對蔗糖的消耗。由此看出接種不同菌種對可溶性糖的消耗不同，所以對老面團特性及代謝物的產(chǎn)生會有不同的影響，最終將影響?zhàn)z頭的品質(zhì)。

老面團，酵母菌，乳酸菌，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器，可溶性糖

我國主食饅頭傳統(tǒng)制作方法是采用老面或酵子等自然發(fā)酵劑發(fā)酵，發(fā)揮了多菌種混合發(fā)酵的優(yōu)勢，蒸制的饅頭風(fēng)味獨特，香甜可口［1］。目前，國外對傳統(tǒng)面包發(fā)酵劑進行了多年研究，包括微生物尤其是乳酸菌的篩選和鑒定，微生物代謝(碳水化合物、蛋白質(zhì)及脂代謝)［2-3］及酸面包風(fēng)味揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生［4-5］等。還研究添加接種純菌發(fā)酵的酸面團對面包品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)添加酸面團能夠改善面包質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味，延遲老化，從而增長面包貨架期等［5-6］。眾所周知，微生物利用面粉中的營養(yǎng)成分生長、繁殖，同時進行代謝作用，代謝作用表現(xiàn)為可溶性糖的消耗和代謝物質(zhì)的產(chǎn)生。酵母菌的代謝產(chǎn)物除CO2外主要為醇類等，乳酸菌和非乳酸菌等細菌的代謝產(chǎn)物為酸類，它們的代謝產(chǎn)物及相互作用形成的新物質(zhì)是構(gòu)成風(fēng)味的重要成分，會直接影響終產(chǎn)品的風(fēng)味。通過pH和TTA值反映細菌的產(chǎn)酸情況，酸化作用可能會影響面團的結(jié)構(gòu)，酵母菌和腐敗菌如霉菌等的生長，最終會影響?zhàn)z頭的質(zhì)構(gòu)、老化特性及貨架期等。但老面團發(fā)酵過程中不同菌種對可溶性糖的利用情況如何，還未見相關(guān)方面的報道。所以本文采用酵母菌和/或乳酸菌接種老面團，研究發(fā)酵過程中微生物生長對可溶性糖的代謝作用，將為饅頭傳統(tǒng)發(fā)酵方法的現(xiàn)代化提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥粉 北京大磨坊面粉有限公司;乙腈 色譜級;水 去離子水;三氯乙酸 分析純;蔗糖標準品 北京化工廠;葡萄糖 北京益利精細化學(xué)品有限公司;D(-)果糖 北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司;D(+)麥芽糖 Sigma;Saccharomyces cerevisiae (CGMCC 2.0562)，Lactobacillusbrevis(CGMCC 1.0579)。

Agilent-1100高效液相色譜儀 美國安捷倫公司;蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)2000 美國奧泰科技(中國)有限公司;LDZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;超凈工作臺北京昌平長城空氣凈化工程公司;3K15高速離心機Sigma;HPS-250生化培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠;醒發(fā)箱 珠海三麥機械有限公司;電子分析天平 奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司;超聲波清洗器(KQ2100DE型、40kHz) 昆山市超聲儀器有限公司;0.22μm微孔濾膜。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 取新鮮培養(yǎng)酵母菌和乳酸菌的斜面菌種一環(huán)，分別接種到裝有20mL無菌麥芽汁和MRS液體培養(yǎng)基，28、30℃培養(yǎng)24h。然后接種到裝有100mL上述培養(yǎng)基的三角瓶，同上培養(yǎng)24h，5000×g，20min，4℃，除去上清液，用無菌水同以上條件清洗2次，獲得微生物的細胞溶于無菌水的菌懸液，酵母菌和乳酸菌的活菌數(shù)分別為106～107cfu/mL。

1.2.2 酸面團的制備 200g面粉，300mL水其中包括酵母菌和/或乳酸菌菌懸液50mL，老面團分別接種單一酵母菌 S.cerevisiae 2.0562和乳酸菌 L.brevis 1.0579;接種二者混合菌種;對照未接任何菌種。混合均勻后于24℃發(fā)酵24h［6］，分別于發(fā)酵的0、4、8、12、16、20、24h取樣測定。

1.2.3 微生物計數(shù)及理化特性測定

1.2.3.1 微生物計數(shù) 菌懸液用無菌移液管準確吸取1mL，加無菌水9mL進行稀釋。10g酸面團與90mL無菌水用超聲波振蕩儀混合2min，進行10倍等梯度系列稀釋。取適當(dāng)濃度梯度稀釋液各0.1mL，分別接種到MRS(0.1g/L放線菌酮)［3-4，7］和麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基平板上，每個梯度做2個平行，于溫度30℃和28℃倒置培養(yǎng)3d進行微生物計數(shù)［8］。

1.2.3.2 pH和滴定酸(TTA)的測定 10g樣品與90mL無菌水用超聲波振蕩儀混勻，用pH計測定［4］。用0.1mol/L NaOH滴定至 pH8.5，記錄所消耗的0.1mol/L NaOH的體積即為TTA值［3］。

1.2.4 可溶性糖的測定

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱:Prevail Carbohydrate ES Columns(250mm×4.6mm，5μm);流動相:乙腈/水(70∶30，V/V，使用前經(jīng)0.45μm濾膜過濾)，流速: 1.0mL/min，柱溫:25℃;ELSD參數(shù):漂移管溫度83.5℃，空氣流速為2.2L/min;進樣量:10μL。

1.2.4.2 標準曲線的制作 準確稱取(精確至0.0001g)干燥至恒重的麥芽糖 0.2g(濃度約為4mg/mL)，果糖、葡萄糖、蔗糖各0.05g(濃度約為1mg/mL)，分別用純凈水定容于50mL容量瓶中。用自動進樣器分別注入1、3、5、7、10μL各糖的標準溶液，以樣品含量為X軸，峰面積為Y軸，分別繪制標準溶液曲線，計算線性回歸方程。同時配制四種糖的混標溶液，使各糖的濃度均約為1mg/mL，進樣量10μL，作標準品色譜圖［9］。

1.2.4.3 樣品測定 準確稱取樣品25g(精確至0.0001g)，置于100mL容量瓶中，加水約50mL，超聲提取20min，慢慢加入50%(質(zhì)量濃度)三氯乙酸溶液5mL，用蒸餾水定容至刻度，混勻，靜置30min，用干燥濾紙過濾，棄去初濾液數(shù)毫升，濾液離心(8000×g，20min，4℃)，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，待上機［9］。

制備好的樣液10μL注入高效液相色譜，在前述測定條件下記錄果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的峰面積，依保留時間分別用外標法計算樣品中的各組分含量，再計算各組分的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物的生長

老面團發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)量的變化如圖1(a)所示，接種酵母菌和乳酸菌的樣品中酵母菌的接種量高于接種單一酵母菌的，隨著發(fā)酵時間的增長菌種數(shù)量增加，10多個小時后酵母菌的數(shù)量基本相等且達到穩(wěn)定，可能是受原料中菌株生長及繁殖所需營養(yǎng)成分的限制。而對照中，酵母菌的數(shù)量逐漸增加，到后期趨勢線漸趨平緩。

細菌數(shù)量的變化如圖1(b)，接種單一乳酸菌的樣品中細菌接種量高于接種酵母菌和乳酸菌的樣品，但約12h時接種混合菌種的樣品中細菌數(shù)量超過接種單一菌種的樣品，其后二者都基本保持穩(wěn)定。很可能是接種混合菌種的樣品中，酵母菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生了一些可供乳酸菌生長繁殖利用的成分而促進了乳酸菌的繁殖。目前原理不明，但可以推斷酵母菌和乳酸菌之間可能會相互影響。對照中主要是非乳酸菌細菌，其主要是面粉中原有或外界帶入的，面粉原料中原有的養(yǎng)分及淀粉酶對破損淀粉作用產(chǎn)生的營養(yǎng)成分供細菌生長、繁殖，所以數(shù)量快速增加。

圖1 S.cerevisiae(CGMCC 2.0562)和/或L.brevis(CGMCC 1.0579)發(fā)酵老面團過程中微生物數(shù)量的變化

2.2 pH和可滴定酸(TTA)值的變化

如圖2(a)所示，接種有乳酸菌的樣品pH較低且下降較快，尤其是接種單一乳酸菌的樣品pH最低。接種單一酵母菌的樣品混合后的前幾個小時內(nèi)pH下降相對較快，然后平緩下降，可能是由于剛形成老面團時面粉中酶及酵母菌的作用所致。對照的pH較高，前20h無明顯變化但最后pH下降較快，這可能是由于細菌作用，由圖1(b)可以看到，隨著發(fā)酵時間的增長對照中細菌大量繁殖，也可能是由于長時間水解作用或原料中的成分變質(zhì)，使得最后pH迅速下降。

如圖2(b)可知，只接種乳酸菌的樣品滴定酸值在前5h迅速增加，其后緩慢增加，第18h滴定酸值最高。前8h接種單一酵母菌和混合菌種的樣品滴定酸值基本相等且都逐漸增加，但8h后接種混合菌種的樣品TTA值快速增加，逐漸高于接種單一酵母菌的樣品，約18h超過接種單一乳酸菌的樣品。對照的TTA值最低，同樣20h后迅速升高，與pH的變化相一致。

圖2 酸面團發(fā)酵過程中pH和TTA變化

2.3 可溶性糖濃度的變化

2.3.1 實驗條件的確定 根據(jù)糖分子都含有極性基團的特點，采用乙睛和水的混合溶劑作流動相，乙腈含量的多少直接影響分離效果。比較了乙腈/水分別為65∶35、70∶30、75∶25、80∶20(V/V)，不同流速及柱溫條件下的實驗結(jié)果，綜合考慮分離效果、峰信號的強弱、分析時間等因素，最終確定色譜條件為:流動相乙腈/水70∶30(V/V)，流速1.0mL/min，柱溫25℃。

蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)在測量半揮發(fā)或不揮發(fā)樣品的光散射之前把流動相蒸發(fā)掉，所以檢測器的響應(yīng)不受溶劑和樣品特殊性質(zhì)的影響，因此對糖類的靈敏度大大高于常用的示差折光檢測器(RID)，所以采用ELSD檢測信號［9］，根據(jù)乙腈與水的比例，ELSD自動設(shè)定參數(shù)為:漂移管溫度83.5℃，空氣流速為2.2mL/min。

2.3.2 標準回歸方程 見表1。

表1 回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.3.3 樣品分析 發(fā)酵過程中各糖濃度變化見圖3。24h樣品的色譜圖見圖4。如圖3(a)所示，前4h主要由于淀粉酶活性即作用于面粉中破損淀粉，四個樣品中麥芽糖濃度都增加，隨后各樣品中麥芽糖的變化趨勢不同。對照樣品，麥芽糖濃度平緩增加，16h后麥芽糖含量基本穩(wěn)定，可能由于微生物消耗和面粉中酶的淀粉水解之間達到平衡［10］;對接種酵母菌的樣品，由于酵母菌對麥芽糖的快速消耗，十幾小時后濃度即降為零;對接種乳酸菌的樣品，麥芽糖的濃度逐漸增加且最高，可能乳酸菌的酸化作用影響原料成分變化和酶的活性;對接種混合菌種的樣品，4～8h麥芽糖濃度有所降低，然后麥芽糖的濃度開始逐漸上升，可能前期酵母菌為主導(dǎo)菌，由于細菌繁殖比較快后期乳酸菌則成為主導(dǎo)菌，因為由接種單一菌種的樣品可知酵母菌使麥芽糖濃度降低，乳酸菌使其濃度上升。

如圖3(b)所示，接種單一酵母菌的樣品，蔗糖的濃度4h時即降為零;接種酵母菌和乳酸菌的樣品蔗糖的濃度降低也較快約9h被消耗殆盡，但慢于接種單一酵母菌的樣品，由此看出，乳酸菌影響酵母菌對蔗糖的代謝。接種單一乳酸菌的樣品蔗糖的濃度最高，雖然某些時間段略有上升，但總體來看呈下降趨勢，可能由于多種原因所致。對照中，前4h內(nèi)蔗糖的濃度上升，隨后緩慢下降。酵母轉(zhuǎn)化酶能把蔗糖水解為葡萄糖和果糖，從而增加乳酸菌的代謝作用［4］，可以通過這種快速的蔗糖水解作用解釋老面團混合后碳水化合物初始量的顯著不同［10］。

圖3 老面團發(fā)酵過程中可溶性糖濃度的變化

由圖3(c)可知，剛形成老面團時葡萄糖的濃度很低，甚至對照和接種混合菌種的樣品中未檢測到葡萄糖，這可能與面粉原料中糖分布的不均勻及樣品處理過程中菌種或酶的作用相關(guān)。接種單一酵母菌的樣品葡萄糖的濃度約8h降為零;接種單一乳酸菌的樣品，葡萄糖濃度增加最快，20h前已高于其他樣品;接種混合菌種的樣品，葡萄糖濃度8h后快速增加，約20h已高于對照。由此看出，酵母菌快速消耗葡萄糖，而乳酸菌的作用使葡萄糖濃度增加，二者混合時前期葡萄糖濃度有所降低，隨后逐漸增加，與麥芽糖的變化趨勢基本相同。由于面粉中淀粉酶對破損淀粉的作用，對照中葡萄糖濃度逐漸增加，但20h后開始下降，可能是長時間發(fā)酵由于雜菌生長及繁殖導(dǎo)致對糖的消耗。接種不同菌種發(fā)酵老面團過程中，葡萄糖濃度變化不同，這與菌種的代謝密切相關(guān)［10］。

果糖以果葡聚糖形式存在面粉中，在所有谷物中的含量約為1%～4%，能夠水解果聚糖β-果糖苷連接鍵的酵母酶(轉(zhuǎn)化酶和菊糖酶)受pH影響，在老面團中活性可能被增強。如圖3(d)所示，對照中果糖的濃度逐漸增大;接種單一酵母菌的樣品，前幾個小時果糖的濃度有所增加，但隨后濃度緩慢降低，約8h已低于其他樣品;接種單一乳酸菌的樣品，果糖濃度的變化波動較大，前4h增加隨后的4h內(nèi)降低，然后快速增加但12h后又有一次迅速下降最后開始增加;接種混合菌種的樣品，前4h內(nèi)果糖濃度有所增加，隨后濃度開始下降，但從約8h濃度開始上升。

圖4 24h樣品高效液相色譜圖

3 結(jié)論

綜上所述，不同菌種的代謝方式存在差異，接種不同菌種發(fā)酵老面團時，各菌種對可溶性糖的消耗不同，所以其生長狀況及代謝產(chǎn)酸存在差異。微生物的代謝作用不僅影響面團結(jié)構(gòu)及特性，還會產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物，由此推斷接種不同菌種發(fā)酵勢必會對成品饅頭的品質(zhì)包括質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、老化特性及貨架期產(chǎn)生不同的影響。接種單一乳酸菌的樣品中細菌接種量高于接種酵母菌和乳酸菌樣品中的，約12h時后者中細菌數(shù)量超過前者。發(fā)酵過程中樣品的酸度為接種單一乳酸菌＞接種混合菌種＞接種單一酵母菌＞對照。高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法可溶性糖的方法為Agilent-1100高效液相色譜儀，Prevail Carbohydrate ES Columns(250mm×4.6mm， 5μm);流動相:乙腈/水70∶30(V/V)，流速: 1.0mL/min，柱溫 25℃;ELSD參數(shù):漂移管溫度83.5℃，空氣流速為 2.2mL/min。S.cerevisiae 2.0562能快速消耗麥芽糖、蔗糖和葡萄糖，對果糖的消耗較慢;接種單一L.brevis 1.0579時，麥芽糖、葡萄糖的濃度增加，總體而言蔗糖濃度呈下降趨勢，果糖呈上升趨勢，雖然二者濃度變化波動較大;接種S.cerevisiae 2.0562和L.brevis 1.0579時，麥芽糖、葡萄糖和果糖的濃度前幾個小時降低，隨后開始增加，乳酸菌的存在減慢了酵母菌對蔗糖的消耗。

若酵母菌和乳酸菌之間存在明確的共生關(guān)系，就能夠增加微生物改善終產(chǎn)品功能和感官特性的潛能。從以上分析來看，本實驗采用的酵母菌為消耗麥芽糖菌種，而麥芽糖消極型酵母能夠水解面粉中的果聚糖，提供內(nèi)源果糖供乳酸菌代謝，所以麥芽糖消極型酵母的篩選是以后研究老面團微生物之間關(guān)聯(lián)性的基礎(chǔ)。

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Metabolism of soluble sugars in old dough fermented by yeast and lactic acid bacteria

SU Dong-hai1，HU Li-hua2，SU Dong-min2，*，XIN Xiu-lan1
(1.Department of Beiology，Beijing Vocational College of Electronic Science，Bijing 100029，China; 2.College of Grain and Food，Henan University of Technology，Zhengzhou 450052，China)

The old dough were prepared using Saccharomyces cerevisiae(CGMCC 2.0562)and/or Lactobacillus brevis(CGMCC 1.0579).The microbial metabolism of soluble sugars was studied during old dough fermentation. The method for detecting soluble sugars，which include maltose，sucrose，glucose，and fructose，was established by high efficiency liquid chromatography-evaporative light scattering.The chromatographic condition:mobile phase was acetonitrile/water which was 70∶30(v/v)，flow rate was 1.0mL/min，column temperature was 25℃.ELSD condition:The temperature of drift tube was 83.5℃，flow rate of carrier gas was 2.2L/min.The results showed that maltose，sucrose and glucose were fast consumed by S.cerevisiae 2.0562，but the consumption of fructose was slower;when old dough fermented by single L.brevis 1.0579，the concentration of maltose，glucose and fructose increase，in general the concentration of sucrose decreased;when old dough fermented by S.cerevisiae 2.0562 and L.brevis 1.0579，the concentration of maltose，glucose and fructose decreased in the initial hours，then increased，however the consumption of sucrose by yeast was slower with existence of L.brevis 1.0579.Thus the consumption of soluble sugars was different when old dough were inoculated by different strains，so they would have different affection on the characteristic of old dough and production of metabolites.This will finally affect the quality of steamed bread.

old dough;yeast;lactic acid bacteria;high efficiency liquid chromatography-evaporative light scattering;the soluble sugars

TS213.2

A

1002-0306(2011)03-0211-04

2010-01-08 *通訊聯(lián)系人

蘇東海(1965-)，男，博士，教授，研究方向:生物技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品加工中的應(yīng)用。

北京市屬高等學(xué)校人才強教深化計劃資助項目(PHR201107151);北京市自然科學(xué)基金資助項目(5093026);河南省重點科技攻關(guān)項目(0523011000)。