李 玲，曾慶坤，唐 艷

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，廣西南寧530001)

雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法測(cè)定水牛初乳中的IGG

李 玲，曾慶坤*，唐 艷

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，廣西南寧530001)

為快速、準(zhǔn)確地測(cè)定水牛初乳中IgG活性質(zhì)量濃度，建立了雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)。結(jié)果表明，IgG活性質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值與吸光值存在很好的線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為γ=-0.2907x2+2.0819x+0.8689，相關(guān)系數(shù)R2=0.9937，線性范圍在7.8～1000ng/mL，平均回收率在84.40%～96.71%之間，靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于水牛初乳及其制品中IgG活性質(zhì)量濃度的檢測(cè)。

酶聯(lián)免疫法，水牛初乳，IgG

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

親和純化牛IgG抗體、標(biāo)準(zhǔn)牛IgG、牛IgG-HRP (酶標(biāo)二抗)等 均購(gòu)自美國(guó)Fitzgerald公司;可溶型單組分TMB(四甲基聯(lián)苯胺)底物溶液 購(gòu)自天根生化科技(北京)公司;Tris堿 Sigma公司生產(chǎn); Na2CO3、NaHCO3、NaCl、Tween-20、H2SO4均為分析純。

酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 芬蘭Labsystems NK3型;離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀L550型;八道可調(diào)式移液器，塑料離心管，96孔酶標(biāo)板，微型振蕩器，電子天平，精密pH計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配備 包被緩沖液:0.05mol/L Na2CO3及0.05mol/L NaHCO3，按照v/v=3∶7混勻后，用二者調(diào)pH至9.6，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

清洗液:0.05mol/L Tris-HCl 800mL，用鹽酸調(diào)pH至8.0，加NaCl 8.1816g以及0.5mL Tween-20混勻，定容至1000mL，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 ELISA法測(cè)定牛IgG的精密度

表3 麼拉水牛初乳中IgG質(zhì)量濃度的變化

樣品/標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋液:0.05mol/L Tris，0.14mol/L NaCl，0.05%Tween-20，pH 8.0，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

封閉液:0.05mol/L Tris，0.14mol/L NaCl，0.05% Tween-20，pH 8.0，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

底物液:TMB-H2O2溶液，即用型，使用前若呈藍(lán)色則不可用，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

終止液:0.18mol/L H2SO4。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制 將24mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)牛IgG進(jìn)行稀釋，得到質(zhì)量濃度為0(空白)、7.8、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000、5000ng/mL的牛IgG標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.2.3 樣品預(yù)處理 取100mL水牛初乳，常溫下4000r/min離心30min，除去上層的脂肪，用20%的鹽酸調(diào)pH至4.6，靜置20min后，常溫下4000r/min離心20min，過濾，濾液用1mol/L的NaOH調(diào)pH至8.0，100mL容量瓶定容，用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)后待檢。

1.2.4 測(cè)定方法 將ELISA試劑盒中的包被抗體稀釋100倍，加100μL至每個(gè)孔，室溫下(20～25℃)反應(yīng)1h，板清洗5次(每次振蕩2～3s后靜置3min，用力甩干，下同)，加200μL封閉液至每個(gè)孔，室溫下反應(yīng)30min，板清洗5次，加100μL標(biāo)準(zhǔn)樣品或者樣品至每個(gè)孔，室溫反應(yīng)1h，板清洗5次，加100μL稀釋105倍的HRP酶標(biāo)二抗至每個(gè)孔，室溫反應(yīng)1h，板清洗5次，加100μL TMB底物液至每個(gè)孔，將酶標(biāo)板在暗處放置，室溫反應(yīng)10～15min，加100μL終止液至每個(gè)孔以終止反應(yīng)，將酶標(biāo)板于酶標(biāo)儀450nm下測(cè)定吸光度值。每個(gè)樣品測(cè)定三次，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 最適酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)的確定

實(shí)驗(yàn)中，對(duì)酶標(biāo)二抗選擇1∶10000、1∶50000、1∶100000、1∶200000、1∶500000五個(gè)稀釋倍數(shù)，結(jié)果表明，采用1∶10000的稀釋倍數(shù)，各孔吸光度值均大于1.8，而采用1∶500000，各孔吸光度值小于0.8。最終選擇1∶100000為酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)。隨著酶標(biāo)二抗儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，可適當(dāng)降低稀釋倍數(shù)以保證酶標(biāo)二抗中酶的活性。不同的廠家生產(chǎn)的酶標(biāo)二抗酶活性有差異，應(yīng)根據(jù)試劑說明書來適當(dāng)稀釋二抗，以達(dá)到最佳實(shí)驗(yàn)條件。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制質(zhì)量濃度為0(空白)、7.8、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000、5000ng/mL的牛IgG標(biāo)準(zhǔn)樣品，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量樣品中的IgG。以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度值的對(duì)數(shù)為Y軸，吸光度值為X軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。在標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度值為7.8～1000ng/mL范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)較好的線性，質(zhì)量濃度超過1000ng/mL后，標(biāo)準(zhǔn)曲線將不再呈線性。

圖1 ELISA法測(cè)定牛IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 精密度

采用上述ELISA方法，連續(xù)測(cè)定同一稀釋濃度水牛乳樣品6次，以檢測(cè)方法的精密度，結(jié)果表明，6次測(cè)定的吸光度值分別為0.386，0.366，0.334，0.375，0.373，0.353，IgG質(zhì)量濃度 6次測(cè)定值 RSD為5.58%。詳見表1。

2.3 回收率

將標(biāo)準(zhǔn)品牛 IgG加入到水牛乳中，采用上述ELISA方法，檢測(cè)添加的標(biāo)準(zhǔn)品牛IgG的回收率。結(jié)果表明，平均回收率可達(dá)84.40%～96.71%，方法回收率高。詳見表2。

表2 ELISA法測(cè)定牛IgG的回收率

2.4 水牛初乳中IgG的檢測(cè)

隨機(jī)選擇三頭產(chǎn)犢日期接近的麼拉水牛，從產(chǎn)犢后第一次擠奶開始采樣，按照本所牛場(chǎng)對(duì)奶水牛的擠奶時(shí)間，每天上午、下午各采集一次，每次間隔時(shí)間約12h，連續(xù)采樣10次，測(cè)定水牛乳中的IgG質(zhì)量濃度。結(jié)果顯示，麼拉水牛產(chǎn)犢后60h以內(nèi)初乳中的IgG質(zhì)量濃度顯著高于常乳中的IgG水平，第一次擠奶的初乳中IgG質(zhì)量濃度達(dá)到85mg/mL以上，產(chǎn)犢后36h以內(nèi)初乳中IgG質(zhì)量濃度均達(dá)到30mg/mL，60h以后，初乳中的IgG質(zhì)量濃度降至10mg/mL以下，詳見表3。

水牛乳中IgG質(zhì)量濃度的變化趨勢(shì)如圖2所示。水牛乳中的IgG質(zhì)量濃度在72h以內(nèi)迅速降至常乳水平，這種下降趨勢(shì)與中國(guó)北方黑白花水牛初乳類似［9］，但下降速度稍緩。麼拉水牛產(chǎn)犢后36h以內(nèi)初乳中IgG質(zhì)量濃度達(dá)到30mg/mL，是開發(fā)水牛初乳制品的優(yōu)質(zhì)奶源。

圖2 麼拉水牛初乳中IgG質(zhì)量濃度變化圖

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了用ELISA測(cè)定水牛初乳中IgG活性質(zhì)量濃度的方法，所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為γ= -0.2907x2+2.0819x+0.8689，相關(guān)系數(shù)R2=0.9937，線性范圍在 7.8～1000ng/mL，回收率在 84.40%～96.71%之間。該方法速度快、特異性強(qiáng)、精密度和回收率高，達(dá)到了檢測(cè)要求，可以用于水牛初乳中IgG的分析。

需要注意的事項(xiàng):a.酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品以及樣品檢測(cè)中吸光度值的影響較大，過高的稀釋倍數(shù)會(huì)使測(cè)定吸光度值偏低甚至不顯色，過低的稀釋倍數(shù)會(huì)導(dǎo)致樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值過高，檢測(cè)中標(biāo)準(zhǔn)品的最低濃度的吸光度值應(yīng)該高于背景值，最高濃度的吸光度值應(yīng)該小于1.8～2.2，以此為標(biāo)準(zhǔn)來確定酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)。b.緩沖液最好為新鮮配制，或在低溫下短時(shí)間內(nèi)儲(chǔ)藏，在測(cè)定之前需用pH計(jì)進(jìn)行校正，配制緩沖液的水必須為超純水或者雙蒸水，緩沖液配制失誤將會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重影響。c.樣品前處理對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響尤為顯著，牛初乳中主要的干擾物為脂肪及酪蛋白，必須除去脂肪以及酪蛋白，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)發(fā)生較大偏差。樣品、標(biāo)準(zhǔn)樣品以及酶標(biāo)二抗必須在加入酶標(biāo)板孔之前再進(jìn)行稀釋。d.清洗必須嚴(yán)格按照操作程序，每次加入清洗液后，振蕩2～3s，靜置3min后，用力一次甩干。清洗不徹底或者清洗過程中造成的孔間的污染均會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

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Detection of IgG in buffalo colostrum by sandwich ELISA

LI Ling，ZENG Qing-kun*，TANG Yan
(Buffalo Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530001，China)

A quick and exact sandwich ELISA was developed for the detection of IgG in buffalo colostrum.The result showed that a good linear relationship existed between the logarithm of IgG concentration and absorbance values，the calibration curve of sandwich ELISA of IgG was γ=-0.2907x2+2.0819x+0.8689，R2was 0.9937，the linear range was 7.8～1000ng/mL，the average recovery was 84.40%～96.71%.The sandwich ELISA of IgG was highly sensitive and reproducible，which made it suitable for detecting IgG in buffalo colostrum and its product.

ELISA;buffalo colostrum;IgG

TS207.3

A

1002-0306(2011)03-0382-03

免疫球蛋白G(IgG)是牛初乳中主要的免疫活性物質(zhì)，占牛初乳免疫球蛋白的80%以上［1］。1977年，Hilpert等［2］將牛IgG添加于嬰幼兒配方乳粉中，發(fā)現(xiàn)其能增強(qiáng)配方乳粉的母乳特性。此后，牛IgG在增強(qiáng)抑菌以及免疫調(diào)節(jié)等多方面的功效也逐漸被研究證實(shí)。目前，牛IgG的檢測(cè)方法主要有單向免疫擴(kuò)散法、瓊脂雙擴(kuò)散法、火箭免疫電泳法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、高效液相色譜法等，其中，酶聯(lián)免疫法以其特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)得到國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛認(rèn)可［3-6］。免疫酶技術(shù)是上世紀(jì)60年代末期發(fā)展起來的一種免疫檢測(cè)方法，1966年Nakene等［7］首先提出免疫酶技術(shù)的基本原理。1971年Engvall等［8］采用ELISA方法測(cè)定IgG含量，使免疫酶技術(shù)成為一種實(shí)用的檢測(cè)技術(shù)。而今，ELISA方法已經(jīng)廣泛用于檢測(cè)體液(如血清)、分泌物(如唾液，乳汁)、排泄物(如尿液，糞便)，以及功能性食品中的某些特異性抗原或者抗體。ELISA方法常用的有:間接法、夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法三種。本研究采用適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原的雙抗體夾心ELISA方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以探索一種快速、準(zhǔn)確測(cè)定水牛初乳中IgG活性質(zhì)量濃度的方法，為水牛初乳及相關(guān)產(chǎn)品的檢測(cè)、鑒定提供依據(jù)。

2010-02-01 *通訊聯(lián)系人

李玲(1984-)，女，碩士，研究方向:乳品科學(xué)與技術(shù)。