李君君 侯善華 何節(jié)玉 夏志月 歐陽健明

(暨南大學(xué)生物礦化與結(jié)石病防治研究所，廣州 510632)

不同粒徑尿微晶的ζ電位、自相關(guān)曲線和聚集狀態(tài)

李君君 侯善華 何節(jié)玉 夏志月 歐陽健明＊

(暨南大學(xué)生物礦化與結(jié)石病防治研究所，廣州 510632)

采用納米粒度儀和透射電子顯微鏡(TEM)比較研究了10例尿石癥患者和10例健康對(duì)照者的尿液經(jīng)不同孔徑濾膜(0.22、0.45、1.2、3.0、10 μm)過濾后，尿微晶平均粒徑(d)、粒度分布、自相關(guān)曲線、ζ電位和聚集狀態(tài)的變化。隨著濾膜孔徑由0.22 μm增至10 μm，患者尿微晶的d值由162 nm增至3 227 nm，自相關(guān)曲線平滑性變差，自相關(guān)時(shí)間(Ta)由1.92 ms增至 2100 ms，ζ由-2.65 mV減小至-9.21 mV，TEM顯示尿微晶尺寸差異大，部分尿微晶處于聚集狀態(tài)。而對(duì)照者尿微晶的d值僅由187 nm增加至1 010 nm，自相關(guān)曲線平滑，Ta由1.40 ms增加至6.67 ms，ζ平均值由-5.22 mV減小至-6.89 mV，TEM顯示尿微晶均勻分散，尺寸較小。上述結(jié)果表明：尿石患者的尿液體系不穩(wěn)定，其尿微晶聚集程度高，導(dǎo)致尿石癥形成的危險(xiǎn)性增加。

納米微晶；ζ電位；TEM；自相關(guān)曲線；聚集

泌尿系結(jié)石(簡稱尿石)除含有少量(質(zhì)量百分?jǐn)?shù)＜5%)的有機(jī)基質(zhì)(如蛋白質(zhì)，類脂類等)外，主要組分為晶體物質(zhì)，如草酸鈣(CaOxa)、尿酸、磷酸鈣等[1-2]。

尿晶體與尿石的形成緊密相關(guān)。雖然對(duì)照者尿液中亦存在草酸鈣尿晶體[3]，但尿石患者的草酸鈣尿晶體比對(duì)照者出現(xiàn)的頻率高，尺寸亦增大[3-4]。因此，在20世紀(jì)70年代曾經(jīng)把尿晶體作為尿石癥活躍程度的指數(shù)。但臨床實(shí)踐上，尿晶體的常規(guī)檢測并沒有得到廣泛的應(yīng)用[5-6]。

尿微晶團(tuán)聚和生長是結(jié)石長大的兩大主要因素。尿液過飽和導(dǎo)致了難溶鹽的成核(納米級(jí)，一般小于10 nm)，然后晶核生長或聚集成病理尺寸的微晶(微米級(jí)，幾十微米)，當(dāng)這些微晶滯留在尿道(自由粒子理論)或被尿道組織所固定(固定粒子理論)時(shí)，尿微晶將逐漸長大并最終形成尿石(毫米級(jí)，一般為幾毫米至幾厘米)[7]。

前文[8-10]我們報(bào)道了尿石癥患者和健康對(duì)照者尿微晶的性質(zhì)差異及其放置不同時(shí)間后微晶的團(tuán)聚程度差異。 本文采用不同孔徑(0.22、0.45、1.2、3.0和10 μm)的濾膜對(duì)10例CaOxa結(jié)石患者和10例對(duì)照者的尿液進(jìn)行過濾，分別得到具有不同粒徑范圍的尿微晶，然后研究兩類尿液中不同尺寸范圍尿微晶的性質(zhì)差異和在成核、生長和聚集等方面存在的差異，這些性質(zhì)包括平均粒徑(從納米到微米)、粒度分布、自相關(guān)曲線、ζ電位和微晶相貌等。期望為闡明尿石癥的形成機(jī)制提供啟示。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

微孔濾膜 (孔徑：0.22、0.45、1.2、3.0 和 10 μm)(上海興亞公司)。常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純?cè)噭?，所有玻璃器皿均用二次蒸餾水洗凈。

1.2 尿液的收集與處理

隨機(jī)收集暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院碎石中心10例草酸鈣結(jié)石患者和10例無結(jié)石病史對(duì)照者的空腹晨尿，參照前文[7]對(duì)尿液進(jìn)行預(yù)處理，然后分別用0.22、0.45、1.2、3.0 和 10 μm 的微孔濾膜過濾，濾液備用。

1.3 尿微晶的納米粒度儀檢測

將上述經(jīng)不同孔徑過濾后的尿液超聲3 min后，用納米粒度儀立即檢測尿微晶的平均粒徑、粒度分布、自相關(guān)曲線和ζ電位。數(shù)據(jù)用x±s表示。

1.4 尿微晶的TEM觀測

上述備用尿液超聲3 min后，用微量進(jìn)樣器取3 μL滴于銅網(wǎng)上，置于真空干燥器中干燥1 d，進(jìn)行TEM觀測。

2 結(jié)果與討論

2.1 尿石患者與對(duì)照者尿微晶的粒度分布差異

2.明確區(qū)縣民宗僑臺(tái)等部門合署辦公的具體規(guī)定。厘清區(qū)縣黨委統(tǒng)戰(zhàn)部與民族宗教部門、臺(tái)辦、僑辦、外辦、僑聯(lián)等合署辦公的職責(zé)職能，對(duì)機(jī)構(gòu)設(shè)置、人員配備包括部門歸屬、科室設(shè)置、人員職數(shù)等作出具體規(guī)定。在區(qū)縣民族宗教部門同統(tǒng)戰(zhàn)部合署辦公后，應(yīng)明確將民族宗教部門保留在政府序列，并配足執(zhí)法人員，確保其執(zhí)法資格不受影響。

10例尿石患者和10例健康對(duì)照者的尿樣經(jīng)不同孔徑濾膜過濾后，其尿微晶的粒度分布、平均粒徑、峰的數(shù)量分別具有相似性，代表性粒度分布圖如圖1a和1b所示?？梢钥闯觯S著濾膜孔徑由0.22 μm 增至 0.45、1.2、3.0 和 10 μm， 患者尿微晶的平均粒徑由165 nm依次增加至353、668、1 484和3 581 nm(圖1b)；而對(duì)照者的平均粒徑由185 nm分別增加為 225、286、396 和 650 nm(圖 1a)。 可見，尿石患者尿液與對(duì)照者之間有明顯的差異性，且隨著濾膜孔徑從 0.22 μm 增加至 10 μm，尿石患者尿液中微晶的平均粒徑顯著增加，幅度為3 416 nm，而對(duì)照者的增加幅度較小，僅為465 nm。這說明患者尿液中大尺寸尿微晶的比例較對(duì)照者的大得多。

經(jīng)不同孔徑濾膜(除 0.22 μm 外)過濾后，患者尿微晶的粒度分布或?yàn)閱畏寤虼蟪叽绶逄貜?qiáng)(圖1b)，而健康對(duì)照者則為雙峰(圖1a)。這說明，對(duì)于尿石患者的尿微晶，在不同的粒徑范圍內(nèi)，大粒徑的尿微晶在數(shù)量上均占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。而在健康對(duì)照者的尿微晶中，小尺寸尿微晶的數(shù)量較多，但也存在大尺寸的尿微晶，因此，在粒度分布圖上表現(xiàn)為雙峰。

當(dāng)尿液用0.22 μm的濾膜過濾后，患者尿微晶的粒度分布圖為雙峰，其中較小的峰在10 nm以下(圖1b)，這可能是該患者尿液中100～200 nm尿晶體的數(shù)量較少，而小于10 nm的微晶較多所致。而在對(duì)照者的尿樣中，100～200 nm的晶體含量較高，尿樣中40 nm以下的晶體數(shù)量所占比例較小，其表現(xiàn)的光散射強(qiáng)度相比100～200 nm的微晶很小，以至于檢測不出來，所以表現(xiàn)為單峰(圖1a)。因?yàn)閳D1a和1b的縱坐標(biāo)均是光散射強(qiáng)度，而大尺寸微晶對(duì)光散射強(qiáng)度的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于小尺寸顆粒。

患者尿液中大尺寸微晶的高比例歸因于其存在的抑制劑較對(duì)照者少[11-12]，導(dǎo)致在體內(nèi)相同的滯留時(shí)間內(nèi)，患者尿微晶生長或聚集的程度較對(duì)照者的大得多。

2.2 尿石患者與對(duì)照者尿微晶的平均粒徑差異

隨著濾膜孔徑由 0.22 μm 增加至 0.45、1.2、3.0和10.0 μm，10例尿石癥患者尿微晶的平均粒徑(d)由 162±35 nm 依次增加至 (252±66)、(566±278)、(1164±460)和(3 227±875)nm(圖 2a)。 相比之下，10例健康對(duì)照者尿微晶的d由187±71 nm分別增加至(233±87)、(357±251)、(568±321)和(1010±554)nm?？梢?，雖然尿微晶的粒徑均隨濾膜孔徑增大而增加，但均比相應(yīng)濾膜的孔徑要小得多。如經(jīng)孔徑10 μm的濾膜過濾后，尿微晶的d＜4000 nm。這說明，經(jīng)孔徑10 μm的濾膜過濾時(shí)，5～10 μm的微晶很少能夠通過濾膜，這一結(jié)果有助于今后研究不同尺寸微晶的性質(zhì)時(shí)選擇合適孔徑的濾膜。

2.3 尿石患者與對(duì)照者尿微晶的光強(qiáng)自相關(guān)函數(shù)差異

尿微晶的光強(qiáng)自相關(guān)函數(shù)能夠反映微晶的大小和尿液的穩(wěn)定性[13]。例如，自相關(guān)曲線衰減越快，求得的自相關(guān)時(shí)間越短，表明尿微晶的粒徑越小。自相關(guān)曲線越平滑，表明尿液越穩(wěn)定；反之，自相關(guān)曲線上下波動(dòng)則表明尿液不穩(wěn)定，尿微晶可能在逐步團(tuán)聚[14]。

圖1c和1d分別為對(duì)應(yīng)于圖1a和1b中兩類尿微晶的光強(qiáng)自相關(guān)曲線。隨著濾膜孔徑由0.22 μm增加至 0.45、1.2、3.0 和 10 μm， 患者尿微晶的自相關(guān)曲線變得越來越不平緩，衰減變化大(圖1d)，其自相關(guān)時(shí)間由 1.92 ms增加至 4.09、20.5、147 和 2 100 ms，增幅顯著(214.53 ms·μm-1)，表明這些尿樣不穩(wěn)定。而對(duì)照者尿微晶的自相關(guān)曲線都很平滑，衰減變化小(圖 1c)，其自相關(guān)時(shí)間由1.40 ms分別增加至 1.62、2.41、4.65 和 6.67 ms，其增幅很小(0.53 ms·μm-1)。即：對(duì)于同一孔徑濾膜過濾的尿微晶，相比對(duì)照者，患者的自相關(guān)曲線衰減慢，曲線不平滑，波動(dòng)性較大。這是由于患者尿液中的大尺寸尿微晶所占的比例大，且隨濾膜尺寸的增加而繼續(xù)增大，而粒子尺寸越大其光散射強(qiáng)度越大，因此，患者尿微晶的光散射強(qiáng)度和自相關(guān)時(shí)間均顯著大于對(duì)照者，且隨濾膜孔徑的增加而變化更加顯著。這說明患者尿液不穩(wěn)定，其尿微晶的生長或聚集速度較快，易形成結(jié)石。

2.4 尿石患者與對(duì)照者的ζ電位差異

尿液中尿微晶的生長是個(gè)緩慢的過程，而尿微晶的團(tuán)聚可在短時(shí)間內(nèi)快速完成[15]。ζ電位的大小直接反映尿微晶之間的靜電排斥力。ζ電位絕對(duì)值越大，表明尿微晶之間的靜電排斥力也越大，尿微晶越難團(tuán)聚。尿液的ζ電位與尿微晶表面電荷及其選擇性吸附的尿液中帶相反電荷的離子的濃度相關(guān)。

圖3為兩類尿微晶經(jīng)不同孔徑濾膜過濾后的ζ電位變化。隨著濾膜孔徑由0.22 μm增加至0.45、1.2、3.0和10 μm，10例尿石患者尿微晶的ζ電位平均值由(-2.65±0.56)mV 分別減小至(-3.75±0.60)、(-4.63±0.69)、(-6.82±1.12)和(-9.21±2.11)mV(圖 3a)，其變化幅度為6.56 mV。相比之下，對(duì)照者尿微晶的ζ電位平均值由(-5.22±0.96)mV依次減至(-5.34±0.82)、(-5.65±0.95)、(-6.61±0.91)和(-6.89±1.17)mV(圖3b)，其變化幅度僅為1.67 mV，遠(yuǎn)小于患者的6.56 mV。

從圖3還可以看出，尿液經(jīng)孔徑0.22、0.45和1.2 μm的濾膜過濾后，對(duì)照者尿微晶的ζ電位比患者的更負(fù)；經(jīng)3.0 μm濾膜過濾后兩者差異不大；而經(jīng)10 μm濾膜過濾后，患者尿微晶的ζ電位(-9.21±2.11)mV比對(duì)照者(-6.89±1.17)mV更負(fù)。

尿液為一膠體體系，尿液中微晶表面形成的雙電層導(dǎo)致了晶體表面與尿液之間存在電勢(shì)差，即ζ電位。ζ電位可近似表達(dá)為均勻帶電球形粒子的表面電勢(shì)[16]。式(1)中ζ為ζ電位，σ為粒子的表面電荷密度，ε為尿樣的介電常數(shù)，κ為Debye-Hückel常數(shù)。尿微晶的ζ電位與粒子的表面電荷密度(σ)成正比。σ一方面與尿液中陰離子抑制劑的濃度有關(guān)，另一方面與尿微晶吸附陰離子的能力有關(guān)。

對(duì)照者尿液中小尺寸微晶的數(shù)量顯著多于患者(圖1a和1b)。由于此次所檢測的10例患者尿液均是CaOxa結(jié)石患者，CaOxa也是尿石的主要組分，而尿微晶與尿石組分之間存在相關(guān)性[17]。對(duì)于小尺寸的納米微晶，由于其存在的許多晶界和大量晶格缺陷[18]，晶體表面電荷少，吸附陰離子的能力弱，ζ電位負(fù)值較小，此時(shí)陰離子濃度的影響對(duì)ζ電位起控制作用[19]。由于對(duì)照者尿液中含有比尿石患者尿液中種類更多、濃度更大或活性更強(qiáng)的抑制物質(zhì)，如檸檬酸鹽、焦磷酸鹽等無機(jī)鹽和硫酸軟骨素、骨橋蛋白、腎鈣素、凝血酶原片斷Ⅰ等尿大分子[11-12]，這些抑制劑大都帶負(fù)電荷。因此，當(dāng)尿液經(jīng)孔徑不大于1.2 μm的濾膜過濾后，測得的主要是小尺寸尿微晶的ζ電位，因而，對(duì)照者尿微晶的ζ電位比患者更負(fù)。

患者尿液中微米級(jí)的大尺寸晶體數(shù)量顯著多于對(duì)照者。大尺寸尿微晶的表面晶格有序，結(jié)構(gòu)完整，晶體表面的晶化程度高，表面電荷多(如一水草酸鈣表面帶正電[20]，但吸附陰離子后帶負(fù)電)。其吸附陰離子能力比小微晶的強(qiáng)得多，因此，雖然患者尿液中陰離子含量較對(duì)照者的低，但由于經(jīng)孔徑10 μm的濾膜過濾后，大尺寸尿微晶的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于小尺寸尿微晶，此時(shí)尿微晶吸附陰離子能力的差異對(duì)ζ電位的影響起控制作用。而患者尿液中大尺寸尿微晶的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照者，導(dǎo)致患者尿微晶的表面負(fù)電荷密度高，ζ電位絕對(duì)值大。

由上可知，患者尿液中的小尺寸的亞微米尿微晶由于比對(duì)照者的所帶負(fù)電荷少，穩(wěn)定性差，易聚集長大形成微米晶體，從而為結(jié)石的形成埋下了隱患。

2.5 尿石患者與健康對(duì)照者尿微晶的形貌差異

采用TEM研究了尿石患者與對(duì)照者尿樣經(jīng)不同孔徑濾膜過濾后的形貌和尺寸，代表性TEM如圖4所示。

尿石患者尿微晶的粒徑隨著濾膜孔徑的增加逐漸增大，粒度分布極不均勻。如經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾后，尿微晶粒徑從30 nm到300 nm不等(圖4a)；而經(jīng)孔徑10 μm的濾膜過濾后，大多數(shù)尿微晶粒徑在 30～2700 nm 之間(圖 4b)。

相比之下，對(duì)照者尿液經(jīng)孔徑0.45 μm的濾膜過濾后，大多數(shù)尿微晶粒徑在100～200 nm之間(圖4c)；而經(jīng)孔徑10 μm的濾膜過濾后，大多數(shù)尿微晶粒徑在 50～1 000 nm 之間(圖 4d)。

比較圖4a、4b與圖4c、4d可以看出，對(duì)照者尿微晶的聚集程度明顯小于尿石患者，這歸因于上面提到的對(duì)照者尿液中含有種類更多、濃度更大或活性更強(qiáng)的陰離子抑制物質(zhì)，這些陰離子抑制劑在尿微晶特別是表面帶正電荷的草酸鈣晶體表面吸附后，使得微晶表面負(fù)電荷密度增加，其ζ電位變負(fù)，晶體表面離子間斥力增加，從而抑制晶體聚集。因此，對(duì)照者尿液中的微晶分散性較好，而尿石患者尿液中的微晶發(fā)生了聚集，這增加了尿石癥形成的危險(xiǎn)性。

3 結(jié) 論

隨著濾膜孔徑從 0.22 μm 增加至 10 μm，尿石患者尿微晶平均粒徑的增幅(～3 000 nm)顯著大于對(duì)照者 (～800 nm)。對(duì)照者的自相關(guān)曲線比患者平滑，自相關(guān)時(shí)間Ta隨孔徑增加而增大，但患者的Ta增幅(214.5 ms·μm-1)顯著大于對(duì)照者(0.33 ms·μm-1)。兩類尿微晶的平均ζ電位亦隨濾膜孔徑增加而變負(fù)，當(dāng)濾膜孔徑不大于1.2 μm時(shí)，對(duì)照者的ζ電位絕對(duì)值比患者大，兩類尿液中的陰離子濃度差異為主要控制因素；而當(dāng)濾膜孔徑為10 μm時(shí)，患者的ζ電位絕對(duì)值比對(duì)照者大，兩類尿微晶的晶格完整程度差異為主要控制因素。尿石患者的尿微晶比對(duì)照者容易團(tuán)聚。

[1]Al-Atar U,Bokov A A,Marshall D,et al.Chem.Mater.,2010,22(4):1318-1329

[2]Saw N K,Rao P N,Kavanagh J P.Urol.Res.,2008,36:11-15

[3]Robertson W G.Physical Chemical Aspects of Calcium Stone Formation in the Urinary Tract.New York:Plenum Press,1976.

[4]Werness P G,Bergert J H,Smith L H.J.Cryst.Growth,1981,53(1):166-181

[5]Daudon M,Hennequin C,Boujelben G,et al.Kidney Int.,2005,67:1934-1943

[6]Daudon M,Jungers P.Nephron.Physiol.,2004,98:31-36

[7]He J Y,Deng S P,Ouyang J M.IEEE Trans.Nanobiosci.,2010,9(2):156-163

[8]ZHAO Mei-Xia(趙美霞),XU Xiao-Jing(許小晶),OUYANG Jian-Ming(歐陽健明).J.Jinan Univ.:Nat.Sci.(Jinan Daxue Xuebao:Ziran Kexue Ban),2007,28(5):486-490

[9]HUANG Zhi-Jie(黃志杰),LI Jun-Jun(李君君),HE Jie-Yu(何節(jié)玉),et al.Spectrosc,Spectr.Anal.(Guangpuxue Yu Guangpu Fenxi),2010,30(7):1913-917

[10]LIU Yi-Ming(柳一鳴),HE Jie-Yu(何節(jié)玉),KUANG Li(鄺荔),et al.Chem.J.Chinese Universities(Gaodeng Xuexiao Huaxue Xuebao),2010,31(5):885-891

[11]Koka R M,Huang E,Lieske J C.Am.J.Physiol.Renal.Physiol.,2000,278:989-998

[12]Michelacci Y M,Glashan R Q,Schor N.Kidney Int.,1989,36(6):1022-1028

[13]Gui B S,Huang Z J,Xu X J,et al.J.Nanosci.Nanotechnol.,2010,10(8):5232-5241

[14]Frisken B J.Appl.Opt.,2001,40(24):4087-4091

[15]He J Y,Ouyang J M,Yang Y E.Mater.Sci.Eng.C,2010,30:878-885

[16]Pawar N,Bohidar H B.J.Chem.Phys.,2009,131(045103):1-7

[17]Gui B S,Xie R,Yao X Q,et al.Bioinorg.Chem.Appl.,2009,925297:1-7

[18]CHEN Quan(陳權(quán)),YUN Shou-Rong(惲壽榕).J.Synth.Crys.(Rengong Jingti Xuebao),2000,29(1):90-93

[19]Sonavane G,Tomoda K,Makino K.Coll.Surf.B,2008,66(2):274-280

[20]OUYANG Jian-Ming(歐陽健明),YAO Xiu-Qiong(姚秀瓊),SU Ze-Xuan(蘇澤軒),et al.Sci.China Ser.B(Zhongguo Kexue B),2003,33(1):14-19

ζ Potential,Autocorrelation Curve and Agglomeration of Urinary Crystallites with Different Size

LI Jun-Jun HOU Shan-Hua HE Jie-Yu XIA Zhi-Yue OUYANG Jian-Ming＊
(Institute of Biomineralization and Lithiasis Research,Jinan University,Guangzhou 510632,China)

By means of nanoparticle size analyzer and transmission electron microscopy (TEM),the effect of membrane pore size on the properties of crystallites in urine of 10 lithogenic patients and 10 healthy subjects were comparatively investigated after urines were filtrated through microporous membrane with a size of 0.22,0.45,1.2,3.0,10 μm,respectively.These properties include average particle size(d),size distribution,intensityautocorrelation curve,ζ potential and aggregation state.With the increase of pore size from 0.22 μm to 10 μm,d value of the urinary crystallites in urine of lithogenic patients increased from 162 nm to 3 227 nm,the autocorrelation time(Ta)increased from 1.92 ms to 2 100 ms,the average value of ζ decreased from-2.65 mV to-9.21 mV,respectively;and the autocorrelation curves were of fluctuating and unsmooth,TEM showed that the size difference of the crystallites was large and some crystallites were in the aggregation state.However,for the crystallites in urine of healthy subjects,d increased only from 187 nm to 1010 nm,Taincreased from 1.40 ms to 6.67 ms,the average value of ζ decreased from-5.22 mV to-6.89 mV,the autocorrelation curves were of regular and smooth,TEM showed that the crystallites were well-dispersed with a smaller size.The above results demonstrated that the urinary system of lithogenic patients is unstable and the aggregation degree of their urinary ctystalllites is high.So the risk of urolithiasis formation of urinary crystallites of patients is larger than that of healthy subjects.

nanocrystalline;ζ potential;TEM;autocorrelation curve;aggregation

O614.23+1

A

1001-4861(2011)12-2425-06

2011-04-01。收修改稿日期：2011-05-24。

廣東省科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.2009B030801236)和國家自然科學(xué)基金(No.30672103)資助項(xiàng)目。＊

。 E-mail：toyjm@jnu.edu.cn