張瑞越, 季 勤, 朱陽陽

(淮陰師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇 淮安 223300)

不同消毒劑對(duì)油菜種子消毒效果的比較

張瑞越, 季 勤, 朱陽陽

(淮陰師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇 淮安 223300)

以油菜種子為實(shí)驗(yàn)材料,研究了不同消毒劑及其不同消毒時(shí)間對(duì)油菜種子的消毒效果,尋找一套適合油菜種子的消毒方法．結(jié)果表明: 0.1%HgCl25?min、10%NaClO 15?min、10% NaClO 10?min+吐溫-80和5%Ca(ClO)210?min+吐溫-80消毒效果較好,在油菜種子實(shí)際消毒時(shí)可考慮選用．

油菜種子; 消毒方法; 消毒效果

0 引言

油菜是我國(guó)第一大油料作物,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位．隨著轉(zhuǎn)基因研究的發(fā)展,油菜的品質(zhì)、抗性和產(chǎn)量得到了明顯的改良[1-2]．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,健壯的無菌苗是有效開展油菜轉(zhuǎn)基因研究和其它組培實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵．從油菜種子獲取的無菌苗可以用于轉(zhuǎn)基因操作,其轉(zhuǎn)基因和組織培養(yǎng)用苗的最佳苗齡是4～7?d,苗的高度大于3?cm[3,4]．但由于油菜種子上通常存在著大量的微生物,其數(shù)量隨著貯存年限的延長(zhǎng)而增加[5],進(jìn)而影響無菌苗的培養(yǎng),使轉(zhuǎn)基因研究和其它組培實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行．因此,油菜種子在發(fā)芽前必須進(jìn)行消毒處理．目前,用于種子消毒的消毒劑較多,常用的有: 次氯酸鈣(Ca(ClO)2)、次氯酸鈉(NaClO)、過氧化氫(H2O2)、溴水、硝酸銀(AgNO3)、升汞(HgCl2)、抗生素等．種子消毒所選擇的消毒劑種類以及它們處理種子的濃度和時(shí)間對(duì)種子的發(fā)芽率和幼苗生長(zhǎng)高度有著直接的影響[6-8]．

本文的目的是研究不同消毒處理對(duì)油菜種子消毒效果的影響,尋找一套適合油菜種子消毒且不影響其種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的消毒方法,為油菜無菌苗的培育及轉(zhuǎn)基因研究提供一定的技術(shù)依據(jù)．

1 材料和方法

1.1 材料

選取籽粒飽滿、顏色正常、大小基本一致的健康油菜種子.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與培養(yǎng)條件

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法

取一定量的種子用70%酒精消毒0.5-1.0?min,然后用無菌水沖洗1次,加入消毒劑消毒．

選用4種消毒劑,分別為0.1%HgCl2、10%H2O2、10%NaClO和5%Ca(ClO)2．實(shí)驗(yàn)分為兩組,第1組為單純的消毒劑,分別用0.1%HgCl2與10%H2O2處理種子5,10和15?min;分別用10%NaClO與5%Ca(ClO)2處理種子10,15和20?min,每處理30粒種子．第2組為添加吐溫-80的消毒劑,10%H2O2+吐溫-80處理種子5,10和15?min;分別用10%NaClO+吐溫-80與5%Ca(ClO)2+吐溫-80處理種子10,15和20?min,每處理30粒種子．

1.2.2 培養(yǎng)條件

將消毒處理后的種子接種于MS培養(yǎng)基,置于25℃光照培養(yǎng)室中,在1600-2000lx光照強(qiáng)度下培養(yǎng)．每天對(duì)種子污染率、發(fā)芽率、3?cm以上植株所占比率等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)記載．

2 結(jié)果與分析

2.1 不添加吐溫-80各消毒劑消毒效果

種子接種于培養(yǎng)基,培養(yǎng)至第3?d,HgCl2、NaClO與Ca(ClO)2各處理的種子全部發(fā)芽．其中, NaClO消毒20?min處理中所長(zhǎng)植株根系比消毒10?min和15?min的根系要少;HgCl2與Ca(ClO)2各處理植株根系之間沒有差異．H2O2各處理的種子,在第2?d有60%開始萌動(dòng),但種子污染也開始出現(xiàn)．實(shí)驗(yàn)中所使用的四種消毒劑對(duì)油菜幼苗莖葉的生長(zhǎng)沒有影響,沒有發(fā)現(xiàn)畸形苗．

在處理后的第7d,對(duì)不同消毒劑不同處理的種子污染率、發(fā)芽率以及3cm以上植株所占比率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)(見表1)．由表1可知,用0.1%HgCl2處理油菜種子5?min,消毒效果最佳,在第7d時(shí),種子污染率最低,發(fā)芽率與3?cm植株所占比率最高;用10%NaClO消毒處理15?min可以獲得同樣的效果．在四種消毒劑中H2O2消毒效果最差,所有處理污染率都很高,而且種子發(fā)芽率和最后的成苗量都很低．統(tǒng)計(jì)結(jié)果經(jīng)方差分析后表明,4種消毒劑12種處理間在污染率、發(fā)芽率和3?cm植株所占比率存在極顯著差異．多重比較后,HgCl2、NaClO與Ca(ClO)2各處理間在發(fā)芽率方面沒有差異,但它們與H2O2各處理間存在顯著差異;污染率方面,HgCl2、Ca(ClO)23個(gè)處理與NaClO15?min、20?min間沒有差異,但它們與NaClO處理10?min和H2O23個(gè)處理間存在顯著差異;在3?cm植株所占比率方面,HgCl2處理5?min與HgCl215?min、NaClO 20?min、Ca(ClO)215?min、20?min以及H2O23個(gè)處理間存在顯著差異,但它與HgCl210?min、NaClO10?min、15?min、Ca(ClO)210?min之間沒有顯著差異．因此,12種處理中用0.1%HgCl2處理5?min、10%NaClO處理15?min和5%Ca(ClO)2處理10?min是油菜種子消毒較為理想的方式．

表1 不添加吐溫-80各消毒劑消毒效果

表中a,b,c表示5%顯著差異水平(LSR檢驗(yàn)),字母相同者表示差異不顯著.

2.2 添加吐溫-80各消毒劑消毒效果

用添加吐溫-80的消毒劑處理種子,在處理后第7d對(duì)種子污染率、發(fā)芽率以及3cm以上植株所占比率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)(見表2)．由表2可知,在H2O2中添加吐溫-80后,污染率明顯降低,進(jìn)而使發(fā)芽率與3cm以上植株所占比率有所提高．但與NaClO、Ca(ClO)2各處理比較,污染率仍然很高．統(tǒng)計(jì)結(jié)果經(jīng)方差分析后發(fā)現(xiàn),3種消毒劑添加吐溫-80后,在污染率方面存在極顯著差異,多重比較后,NaClO、Ca(ClO)2各處理與H2O2各處理間存在顯著差異;而發(fā)芽率和3?cm以上植株所占比率沒有顯著差異．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,10%NaClO+吐溫-80和5%Ca(ClO)2+吐溫-80處理油菜種子10?min是最為理想的消毒方式．

表2 添加吐溫-80各消毒劑消毒效果

表中a,b,c表示5%顯著差異水平(LSR檢驗(yàn)),字母相同者表示差異不顯著.

3 討論

無菌苗培養(yǎng)及其長(zhǎng)勢(shì)是組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因的關(guān)鍵,組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因用苗的最佳苗齡是4～7?d,當(dāng)苗齡超過7?d,無菌苗則開始老化,不適于進(jìn)一步的試驗(yàn)[3,4]．因此,本試驗(yàn)對(duì)消毒劑消毒后第7?d種子污染和幼苗生長(zhǎng)高度等情況進(jìn)行了分析研究．

在本研究所選用的四種消毒劑中,HgCl2的消毒效果最好．HgCl2的三個(gè)處理污染率均為0;單一的NaClO與Ca(ClO)2處理10?min都有污染,而其它時(shí)間段(15和20?min)無污染,但當(dāng)它們與吐溫-80混合使用后,三個(gè)處理均無污染發(fā)生;H2O2無論是單獨(dú)使用還是與吐溫-80混合使用,其消毒效果都是最差,隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng),種子污染率反而提高,達(dá)到100%,這可能是由于H2O2具有腐蝕作用,消毒后會(huì)加大種子內(nèi)可溶性物質(zhì)向外滲漏,導(dǎo)致種子污染[4,5]．

吐溫-80是一種非離子表面活性劑,穩(wěn)定性高,不易受酸、堿及強(qiáng)電解質(zhì)的影響．在藥劑消毒時(shí),加入少量吐溫-80,它可以降低消毒劑和消毒材料之間的表面張力,使消毒劑迅速擴(kuò)散到消毒材料表面,進(jìn)而提高殺菌效果．H2O2各處理添加吐溫-80后,其污染率都明顯比單一使用H2O2處理的有所降低．

綜合對(duì)油菜種子的消毒情況、生長(zhǎng)情況和多重比較分析的結(jié)果可知,對(duì)油菜種子消毒采用0.1%HgCl25?min、10%NaClO 15?min、10%NaClO10?min+吐溫-80和5%Ca(ClO)210?min+吐溫-80的消毒效果為最佳．

[1] 咸拴獅,羅曉麗,王劍.油菜轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展?[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(3):85-88.

[2] 管春云.油菜的轉(zhuǎn)基因育種?[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào),2005,27(1):97-103.

[3] 李勁峰,鄭樹松,蔣海玉,等. 油菜無菌苗最佳生長(zhǎng)條件的探討?[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(1):34-35.

[4] 李旭嬌,田保明,范興福,等.甘藍(lán)型油菜無菌苗培養(yǎng)方法的優(yōu)化?[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,(6):35-37.

[5] 杜燕,蔣海玉,劉其寧.貯存過期油菜種子消毒方法的研究?[J].種子,2003,(2):39-42

[6] 吳志剛,宋明,王志敏,等.番茄組織培養(yǎng)中無菌苗培養(yǎng)條件的優(yōu)化?[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2006,22(4):335-337.

[7] 張強(qiáng),李琰,張興.除蟲菊組織培養(yǎng)中種子及幼苗消毒方法的研究?[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(2):27-28.

[8] 胡重怡,鄭少清,陳興江,等.煙草無菌苗培養(yǎng)前的種子消毒技術(shù)研究?[J].中國(guó)煙草科學(xué),2007,28(2):45-51.

[責(zé)任編輯：蔣海龍]

StudyontheDisinfectionEffectofDifferentDisinfectantonRapeseed

ZHANG Rui-yue, JI Qin, ZHU Yang-yang

(School of Life Sciences, Huaiyin Normal University, Huaian Jangsu 223300, China)

This experiment was conducted to find out the best sterilization method for the rapeseed through investigating effects of different disinfectant agents and disinfectant times on the rapeseed. The results showed that the better sterilization methods were disinfected rapeseed with 0.1% HgCl2for 5 minutes, 10% NaClO for 15 min, 10% NaClO+tween-80 for 10 min and 5% Ca(ClO)2+tween-80 for 10 min, respectively.

rapeseed; disinfection methods; disinfection effect

S604+.1

A

1671-6876(2011)02-0127-03

2010-11-22

張瑞越(1979-), 女, 新疆伊寧人, 講師, 碩士, 主要從事植物生物技術(shù)的教學(xué)與研究.