王曉輝，王文雅，*，袁其朋，歐陽艷

（1.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100029；2.伊犁師范學(xué)院化學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，新疆伊寧835000）

H2O2催化預(yù)處理對玉米芯酶解的影響

王曉輝1，王文雅1，*，袁其朋1，歐陽艷2

（1.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100029；2.伊犁師范學(xué)院化學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，新疆伊寧835000）

木糖通常經(jīng)半纖維素水解而得，而富含半纖維素的玉米芯細(xì)胞中同時也含有木質(zhì)素與纖維素，與半纖維素緊密纏繞，阻礙了其水解，因此預(yù)處理便成了生產(chǎn)木糖過程中的一個必要的步驟。經(jīng)實驗優(yōu)化所得預(yù)處理最佳工藝條件為：室溫，固-液比1∶20，pH5.0，H2O2量3.05%，F(xiàn)e2+添加量0.15g，處理時間2.56h。在此條件下H2O2催化預(yù)處理后，用木聚糖酶進(jìn)行酶解，木糖和葡萄糖得率分別比未處理的0.1895、0.1672g/g玉米芯提高到0.2676、0.2930g/g玉米芯。而經(jīng)木聚糖酶和纖維素酶（雙酶）進(jìn)行酶解后又分別提高到0.2856、0.3321g/g玉米芯，證明H2O2催化預(yù)處理是一種有效可行的預(yù)處理方法。

H2O2，F(xiàn)e2+，預(yù)處理，木糖

1 材料與方法

1.1 實驗材料

玉米芯 購于北京郊區(qū)，自然風(fēng)干的玉米芯粉碎至20目后，用擠壓機進(jìn)行擠壓膨化，再在室內(nèi)風(fēng)干，玉米芯樣品中纖維素含量為38.4%，半纖維素含量為32.4%，木質(zhì)素含量為9.2%；木聚糖酶 酶活力6000萬U/g，湖州禮來公司；纖維素酶 酶活力6000萬U/g，夏盛公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗工藝流程 玉米芯→擠壓膨化、風(fēng)干→H2O2催化預(yù)處理→洗滌過濾、烘干濾渣→酶解→過濾、測濾液中的單糖。

其中H2O2催化預(yù)處理為影響酶解產(chǎn)率的關(guān)鍵步驟，對其進(jìn)行了如下優(yōu)化實驗，以確定最佳條件。

1.2.2 玉米芯的H2O2預(yù)處理單因素實驗 在錐形瓶中加入一定量的玉米芯和H2O2溶液，溫度25～100℃，固-液比1∶10～1∶40，pH3.0～7.0，時間1～24h，分別進(jìn)行預(yù)處理后抽濾，分離處理試樣與溶液，用去離子水洗滌處理試樣殘渣，60℃下干燥至恒重，儲存待后續(xù)酶解及成分測定。

在以上確定的最佳條件下，在玉米芯中加入Fe2+0.01～0.25g，并將時間縮短為10～180min，分別進(jìn)行預(yù)處理后抽濾，分離處理試樣與溶液，用去離子水洗滌處理試樣殘渣，60℃下干燥至恒重，儲存待后續(xù)酶解及成分測定。

1.2.3 玉米芯的酶解糖化 為判定不同預(yù)處理條件對后續(xù)木聚糖酶降解玉米芯的過程產(chǎn)生的影響，對各試樣進(jìn)行了酶水解反應(yīng)。采用檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液（pH=4.8）將固體木聚糖酶在45℃水浴中溶解，酶濃度為50g/L。在45℃，200r/min恒溫?fù)u床內(nèi)反應(yīng)72h后過濾，測定其中單糖產(chǎn)量。

首先，嚴(yán)格落實統(tǒng)一供種、統(tǒng)一水肥管理、統(tǒng)一技術(shù)指導(dǎo)、統(tǒng)一病蟲害防治、統(tǒng)一機械化操作的五統(tǒng)一技術(shù)路線，確保整個示范區(qū)內(nèi)各項工作的統(tǒng)一性。同時還要在示范區(qū)內(nèi)明確標(biāo)志示范牌，示范牌要詳細(xì)注明創(chuàng)建單位、主導(dǎo)品種、產(chǎn)量目標(biāo)和關(guān)鍵生產(chǎn)技術(shù)。同時還要確保有專業(yè)技術(shù)人員負(fù)責(zé)，有專業(yè)配套措施扶持，定期開展觀摩示范活動計劃，有效發(fā)揮示范區(qū)的宣傳示范帶動作用。

為判定雙酶酶解結(jié)果，在上述酶解條件下加入纖維素酶進(jìn)行反應(yīng)，酶濃度為50g/L，其它條件同上。過濾后測濾液中的單糖產(chǎn)量。酶解條件由一系列單因素實驗獲得。

1.2.4 響應(yīng)曲面（RSM）實驗 借助于design expert軟件，根據(jù)box-behnken設(shè)計，采用3因素3水平共17個實驗點（因素水平見表1）進(jìn)行響應(yīng)面分析。

表1 響應(yīng)面因素水平表

1.2.5 分析方法

1.2.5.1 玉米芯成分測定 原理為Van Soest法，還原糖的分析采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法，單糖用高效液相色譜分析。柱型號：COSMOSIL Sugar-D；規(guī)格：5μm×4.6mm×250mm；流動相：乙腈∶水=75∶25；柱溫：30℃；流速：1mL/min；檢測器：蒸散光檢測器。

1.2.5.2 掃描電鏡分析 將未處理的玉米芯和H2O2催化預(yù)處理的玉米芯樣品用導(dǎo)電膠帶固定在銅臺上，噴金后用JSM.6360LV掃描電子顯微鏡觀察。

1.2.5.3 紅外分析 采用傅立葉變換紅外光譜儀對未處理的玉米芯和H2O2催化預(yù)處理的玉米芯樣品進(jìn)行紅外光譜分析。

1.2.6 計算方法 酶解單糖得率=反應(yīng)生成的單糖濃度×體積/玉米芯質(zhì)量

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米芯的H2O2預(yù)處理單因素實驗

2.1.1 預(yù)處理中H2O2量對玉米芯成分及酶解的影響不同體積分?jǐn)?shù)的H2O2預(yù)處理后的玉米芯木質(zhì)素成分分析和酶解糖化結(jié)果見表2。由表2的數(shù)據(jù)分析可知，隨著預(yù)處理H2O2體積分?jǐn)?shù)的增大，玉米芯的失重率升高，而酶解后糖化率也升高。H2O2預(yù)處理對木質(zhì)素的氧化降解程度明顯，而纖維素與半纖維素的損失率非常小。綜合考慮木質(zhì)素降解量與酶解糖得率，確定H2O2體積分?jǐn)?shù)為3%時最佳。

表2 不同體積分?jǐn)?shù)的H2O2預(yù)處理結(jié)果

2.1.2 溫度對酶解單糖得率的影響 隨溫度的升高，酶解所得單糖量減少，分析原因可能是溫度較高時H2O2不穩(wěn)定，分解為H2O和O2，從而使其對木質(zhì)素的氧化降解作用基本消失。

表3 不同溫度H2O2預(yù)處理結(jié)果（g/g玉米芯）

2.1.3 H2O2預(yù)處理固-液比對酶解的影響 隨著固-液比的增加，單糖得率有明顯提高，但增加到一定程度單糖得率開始緩慢降低，且固-液比太大會使多余的H2O2無效分解，造成浪費。當(dāng)固-液比為1∶20時，單糖得率最高。

圖1 單糖產(chǎn)量隨固液比的變化

2.1.4 pH與時間的影響 H2O2對木質(zhì)纖維素的氧化過程，是H2O2對木質(zhì)素進(jìn)行氧化降解和H2O2發(fā)生無效分解兩個相競爭的過程。中性和酸性條件下H2O2相對較穩(wěn)定，在pH3.0、4.0、5.0、7.0下對玉米芯進(jìn)行H2O2預(yù)處理1、2、3、4、5、12、24h后，由結(jié)果可知，pH5.0、處理3h時單糖得率最高。

圖2 單糖產(chǎn)量隨pH和時間的變化

2.1.5 Fe2+添加量 Fe2+/H2O2體系可以方便地產(chǎn)生羥基自由基（·OH）：Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH，所產(chǎn)生的羥基自由基（·OH）的反應(yīng)活性遠(yuǎn)高于過氧化氫本身的反應(yīng)活性。由圖可知，隨著Fe2+添加量的增加，玉米芯的酶解單糖得率增加，但增加到一定程度會使玉米芯迅速變?yōu)楹稚橛忻黠@的放熱反應(yīng)，表明玉米芯H2O2氧化程度過大。單因素實驗結(jié)果表明，F(xiàn)e2+添加量為0.15g時單糖得率最高。

圖3 單糖產(chǎn)量隨Fe2+添加量的變化

2.1.6 Fe2+處理時間 由圖可知，加入Fe2+催化劑之后單糖得率增加，且最佳處理時間也有所縮短。單因素實驗結(jié)果表明，F(xiàn)e2+添加量為0.15g、處理時間為2.5h時木糖得率最高，處理時間2h時葡萄糖得率最高。

圖4 單糖產(chǎn)量隨催化預(yù)處理時間的變化

2.2 雙酶酶解結(jié)果

圖5 單酶與雙酶酶解結(jié)果比較

玉米芯經(jīng)H2O2處理后單糖得率明顯提高，用木聚糖酶酶解后木糖和葡萄糖得率分別比未處理的0.1895、0.1672g/g玉米芯提高到0.2676、0.2930g/g玉米芯，而經(jīng)雙酶酶解后又分別提高到0.2856、0.3321g/ g玉米芯。

2.3 響應(yīng)曲面（RSM）分析

響應(yīng)面分析（RSA）法采用多元二次回歸方程作為函數(shù)估計的工具，將多因子實驗中因素與指標(biāo)的相互關(guān)系用多項式表達(dá)，以此可對函數(shù)的響應(yīng)值和等值線進(jìn)行分析，研究因子與響應(yīng)面之間、因子與因子之間的相互關(guān)系[9-10]。實驗分析方案與結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面分析方案與結(jié)果

由Design-Expert軟件分析，將H2O2濃度、Fe2+添加量、處理時間三個參數(shù)分別固定，木糖得率隨其余兩個參數(shù)變化的響應(yīng)面圖見圖6。

圖6 木糖得率隨參數(shù)變化的響應(yīng)面圖

表5 回歸方差分析結(jié)果

用Design-Expert軟件的RSM分析系統(tǒng)對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到木糖得率的回歸方程為：

Y=28.53-0.15A+0.32B+0.17C-0.33AB+0.21AC+ 0.31BC-0.99A2-1.62B2-1.83C2。從回歸方程的方差分析（表5）中可以看出，用上述回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的變化關(guān)系時，其因變量與所有自變量之間的關(guān)系是顯著的，相關(guān)系數(shù)R2=93.24%，方程的F值為10.73，顯著系數(shù)為0.0025，說明方程是顯著的。

由RSM分析系統(tǒng)得出實際的最佳預(yù)處理條件下的方程為：Y’=-37.31350+136.145A+33.0875B+8.9685C-13.2AB+4.25AC+0.615BC-396.4A2-6.464B2-1.8285C2

為了進(jìn)一步確證最佳的預(yù)處理條件，將Y’方程分別對A、B、C求一階偏導(dǎo)并使其等于零，用Matlab進(jìn)行數(shù)據(jù)運算，解此方程組得到A=0.15，B=2.56，C=3.05，即預(yù)處理最佳工藝條件：Fe2+添加量為0.15g，處理時間2.56h，H2O2量為3.05%，可求得木糖得率為28.5609%，即0.2856g/g玉米芯。

2.4 H2O2催化預(yù)處理對玉米芯表觀形態(tài)的影響

由圖7可見，未處理20目玉米芯表面平整光滑，結(jié)構(gòu)比較緊密，孔隙度不高。

圖7 未處理玉米芯

圖8為H2O2催化預(yù)處理后的20目玉米芯，可見經(jīng)預(yù)處理之后玉米芯表面結(jié)構(gòu)發(fā)生了很明顯的變化，表面出現(xiàn)裂痕剝落，斷面開裂分層，結(jié)構(gòu)蓬松，且孔隙度大為提高，這使玉米芯的比表面積增加，充分說明了H2O2催化預(yù)處理后玉米芯更易于酶的進(jìn)攻，有利于提高酶解單糖得率。

圖8 H2O2/Fe2+催化處理玉米芯

2.5 H2O2催化預(yù)處理對玉米芯內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響

圖9 紅外分析圖譜

3420～3430cm-1處的吸收峰為醇和酚分子中的OH寬峰振動；2921cm-1處的吸收峰為CH3和CH2的CH對稱和反對稱振動；1633cm-1處的吸收峰為木質(zhì)素C=C伸展振動；1602cm-1處的吸收峰為芳香環(huán)C=C鍵；1515cm-1處的吸收峰為木質(zhì)素苯環(huán)伸展振動；1463cm-1處的吸收峰為木質(zhì)素和聚木糖CH2彎曲振動、木質(zhì)素苯環(huán)振動；1265cm-1處的吸收峰為苯環(huán)骨架振動、愈創(chuàng)木基型C=O伸縮振動；1170cm-1處的吸收峰為纖維素和半纖維素中C-O-C的振動；1117～1124cm-1處的吸收峰為C-H苯環(huán)、紫丁香型C-H振動。這些吸收峰強度經(jīng)H2O2處理后都有所減弱，說明經(jīng)H2O2處理后木質(zhì)素部分降解溶出。

3 結(jié)論

本研究在已獲取最佳酶解處理條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行了與酶解處理相結(jié)合的Fe2+/H2O2預(yù)處理條件的優(yōu)化實驗。預(yù)處理條件的優(yōu)化分別從溫度、H2O2體積分?jǐn)?shù)、固-液比、pH、預(yù)處理時間、Fe2+添加量等幾個方面來進(jìn)行，并對其中相互影響較大的三個因素用響應(yīng)面進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。RSM實驗分析結(jié)果表明，在室溫、pH5.0、H2O2體積分?jǐn)?shù)為3.05%、固-液比為1∶20、預(yù)處理時間為2.56h、Fe2+添加量為0.16g的條件下，預(yù)處理的玉米芯的酶解產(chǎn)木糖量可達(dá)到0.2856g/g。

通過電鏡和紅外圖譜分析可知，經(jīng)Fe2+/H2O2預(yù)處理后的玉米芯因部分木質(zhì)素的氧化降解溶出而表面出現(xiàn)裂痕剝落，斷面開裂分層，結(jié)構(gòu)蓬松，孔隙度大大提高，使酶更易于與玉米芯半纖維素接觸，提高木糖產(chǎn)率，且使酶用量減少了10%，更有利于工業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。

本實驗優(yōu)化出與酶解處理法相結(jié)合的、廉價的Fe2+/H2O2預(yù)處理方法，為木糖的工業(yè)生產(chǎn)提供了低成本、高效率的預(yù)處理工藝，具有較好的應(yīng)用前景。

[1]賀東海,趙光輝,聶圣才.木糖的功能特性及應(yīng)用[J].中國食物與營養(yǎng),2006（2）:27-28.

[2]趙律,李志光,李輝勇,等.木質(zhì)纖維素預(yù)處理技術(shù)研究進(jìn)展[J].化學(xué)與生物工程,2007,24（5）:5-8.

[3]Kevin A G,Zhao L S,Mark E.Bioethanol[J].Current Opinion in Chemical Biology,2006,10:141-146.

[4]李十中.生物質(zhì)工程前沿領(lǐng)域關(guān)鍵技術(shù)研究進(jìn)展[J].生物質(zhì)工程研究專題,2005,23（5）:9-l1.

[5]Saha B C,CoRa M A.Ethanol production from alkaline peroxide pretreated enzymatically saccharified wheat straw[J].Biotechnol Prog,2006,22:449-453.

[6]Saha B C,Iten L B,Cotta M A,et al.Dilute acid pretreatment, enzymatic saccharification and fermentation of wheat straw to ethanol[J].Process Biochemistry,2005,40:3693-3700.

[7]Ruiz E,Cara C,Ballesteros M,et al.Ethanol production from pretreated olive tree wood and sunflower stalks by an SSF process[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2006，132：631－643.

[8]Ojumu T V,Ogunkunle O A.Production of glucose from lignocellulosic under extremely low acid and high temperature in batch process,auto-hydrolysis approach[J].Journal of Applied Sciences,2005,5（1）:15-17.

[9]李亞娜,林永成,佘志剛.響應(yīng)面分析法優(yōu)化羊菜多糖的提取工藝[J].華南理工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2004,32（11）:281.

[10]孟春玲,王建中,王豐俊,等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取沙棘籽油的工藝研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,30（5）:118-122.

Effect of catalyzed H2O2pretreatment on the enzymatic hydrolysis of corn cob

WANG Xiao-hui1,WANG Wen-ya1，*,YUAN Qi-peng1,OUYANG Yan2
（1.Life Science and Technology Institute,Beijing University of Chemical,Beijing 100029，China；2.Chemical and Bio-science Institute,Yili Normal University,Yining 835000，China）

Xylose is usually obtained by the hydrolysis of hemi-cellulose.But the existing of lignin and cellulose，which are intertwining with hemi-cellulose in corn cob hinders the hydrolyzing process.So pretreatment becomes a necessary procedure for xylose producing.The optimized conditions were obtained as follow:room temperature，solid-to-liquid ratio was 1∶20，pH5.0，H2O2concentration was 3.05%，additive amount of Fe2+was 0.15g，and pretreatment time was 2.56h.After this catalyzed H2O2pretreatment，the xylanase hydrolysis yield of xylose and glucose had reached 0.2676，0.2930g/g corncob，and the yield of un-pretreated corncob was 0.1895，0.1672g/g.While cellulase was added，the yield of xylose and glucose came up to 0.2856，0.3321g/g.It was proved that catalyzed H2O2pretreatment was an effective and feasible pretreatment.

H2O2；Fe2+；pretreatment；xylose

TS210.1

B

1002-0306（2011）10-0268-05

2010－11－09 *通訊聯(lián)系人

王曉輝（1984-），女，碩士研究生，研究方向：生物質(zhì)預(yù)處理。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863）（2009AA02Z202）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費項目（ZZ1026）；新疆維吾爾自治區(qū)高校科研計劃項目（XJEDU2008I32）。