梁 斌，任昌安，李文星，閻慧明，商中華，韓曙光 (中國人民解放軍總醫(yī)院肝膽外科醫(yī)院，全軍肝膽外科研究所，北京 00853;山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院普通外科;通訊作者，E-mail:doctorlb@63.com)

梗阻性黃疸是指由于肝外膽管梗阻所致的膽汁淤積性疾病，可導(dǎo)致嚴(yán)重的全身性的病理生理改變［1］。研究顯示肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在肝臟微循環(huán)中具有重要的調(diào)節(jié)作用［2－5］，并具有吞噬清除、合成細(xì)胞外基質(zhì)及脂質(zhì)代謝等功能，在梗阻性黃疸肝臟損傷中起到重要作用［6，7］，而有關(guān)梗阻性黃疸時肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的損傷報(bào)道較少。本文動態(tài)觀察梗阻性黃疸后血清透明質(zhì)酸變化及其與中性粒細(xì)胞聚集之間的關(guān)系，對肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及機(jī)制作深入探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型制作 雄性健康Wistar大鼠60只，體重250－300 g，由山西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。動物隨機(jī)分為:膽總管結(jié)扎組和假手術(shù)組(只游離膽總管但不結(jié)扎組)，每組各30只。膽總管結(jié)扎組根據(jù)術(shù)后不同的時間分為1 d，3 d，7 d，14 d，21 d 共 5 個小組，分別記為 OJ1，OJ3，0J7，OJ14，OJ21，每組6只。大鼠均常規(guī)喂養(yǎng)，術(shù)前12 h禁食，不禁水，采用3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，備皮消毒后，取上腹正中縱切口，長約3 cm，尋找膽總管并于近肝門處0#絲線行三重結(jié)扎，在近端兩處和遠(yuǎn)端一處間剪斷。假手術(shù)組只游離膽總管，不結(jié)扎離斷膽總管，與膽總管結(jié)扎組類似，按術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d 不同時間點(diǎn)分為5 個小組，分別 SM1、SM3、SM7、SM14、SM21。各組在相應(yīng)的時間點(diǎn)，經(jīng)腹主動脈抽取血液，離心后將血清保存于－20℃冰箱待測;取血后，切取不同部位肝臟組織3塊，分別用于髓過氧化物酶測定、組織病理學(xué)檢測以及濕干比重測定。

1.2 儀器與試劑 分析天平、Olympus光學(xué)顯微鏡、722分光光度儀、NS-648型放射免疫γ計(jì)數(shù)器。透明質(zhì)酸放射免疫測定盒(上海海研醫(yī)學(xué)生物技術(shù)中心)、肝臟組織髓過氧化物酶(MPO)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血清總膽紅素、血清肌酐檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 血清透明質(zhì)酸及其他血清學(xué)指標(biāo)測定 血清透明質(zhì)酸測定采用放射免疫法;血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶:賴氏法;血清總膽紅素:固蘭B法;血清肌酐:苦味酸不除蛋白法。MPO測定:取冰凍新鮮肝臟組織樣本，制備成濃度為5%的組織勻漿，然后加入H2O2顯色劑，水浴后立即在460 nm處測定OD值。具體方法參照MPO測試盒說明。MPO活力以37℃反應(yīng)體系中H2O2被分解1 μmol為1個活力單位。MPO活性(U/g)=(測定管 OD值－對照管 OD值)/11.3×取樣量。以上各指標(biāo)的檢測均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.4 組織病理學(xué)檢查 切取大鼠部分肝臟，經(jīng)10%的中性甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色。在高倍鏡下(HPF×1 000)隨機(jī)取50個視野行雙盲法中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，以評價其聚集程度。

1.5 肝臟組織濕干比 切取部分肝臟標(biāo)本，置于55℃的烘箱內(nèi)烘烤至少72 h或者至取得一恒定數(shù)值為止。肝臟組織濕干比=肝臟濕重/干燥后重量。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均用±s表示，采用SPSS10.0軟件分析，采用One-way ANOVA進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 血清總膽紅素和谷丙轉(zhuǎn)氨酶 假手術(shù)組各時間點(diǎn)血清總膽紅素及血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶之間沒有明顯變化(P＞0.05)，故未將SM各組數(shù)據(jù)列出，而將其作為一整體與OJ各組進(jìn)行比較。與假手術(shù)組相比，膽總管結(jié)扎組血清總膽紅素于膽總管結(jié)扎后1 d即明顯增高(P＜0.01)，術(shù)后3 d達(dá)到高峰，其后保持在較高水平。膽總管結(jié)扎組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶于術(shù)后1 d即明顯增高(P＜0.01)，術(shù)后14 d血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶有所下降，但仍明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)，見表1。

表1血清總膽紅素和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的變化(±s)Tab 1 Changes of serum total bilirubin and serum alanine aminotransferase in obstructive jaundice group and sham operation group at different time points after operation(±s)

表1血清總膽紅素和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的變化(±s)Tab 1 Changes of serum total bilirubin and serum alanine aminotransferase in obstructive jaundice group and sham operation group at different time points after operation(±s)

與假手術(shù)(SM)組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 n T-BIL/(μmol/L) ALT(IU/L)SM組30 4.04 ±0.77 19.00 ±5.59 OJ1 組 6 96.80 ±3.41＊＊ 243.00 ±23.08＊＊OJ3 組 6 165.70 ±8.02＊＊ 84.02 ±7.37＊＊OJ7 組 6 154.00 ±11.62＊＊ 116.64 ±10.78＊＊OJ14 組 6 149.57 ±10.88＊＊ 63.14 ±8.60＊＊OJ21 組 6 139.65 ±9.38＊＊ 33.58 ±7.77*

2.2 血清透明質(zhì)酸和肌酐 ①假手術(shù)組血清透明質(zhì)酸于術(shù)后1 d均明顯高于該組術(shù)后其他時間(P＜0.01)，與膽總管結(jié)扎組相比較仍明顯減少(P＜0.05)，見表2。膽總管結(jié)扎組血清透明質(zhì)酸在術(shù)后3 d及其后的時間均明顯高于相應(yīng)的假手術(shù)組(P＜0.01)，術(shù)后 21 d 達(dá)到高峰(P＜0.01)，見表 2。②膽總管結(jié)扎組血清肌酐較假手術(shù)組增高明顯(P＜0.05)，其高峰出現(xiàn)在手術(shù)后第3天。膽總管結(jié)扎組和假手術(shù)組組內(nèi)血清肌酐未見明顯變化(P＞0.05)，見表2。③膽總管結(jié)扎組血清透明質(zhì)酸的增高早于血清肌酐的增高，且并未隨其發(fā)生相應(yīng)變化。

經(jīng)相關(guān)分析顯示膽總管結(jié)扎組血清透明質(zhì)酸與血清肌酐變化之間無明顯相關(guān)性(Pearson相關(guān)系數(shù)r雙側(cè)=－0.036，P=0.849)。

2.3 肝臟組織髓過氧化物酶含量及濕干比 ①肝臟組織中髓過氧化物酶反映中性粒細(xì)胞在肝臟內(nèi)的聚集程度。隨著手術(shù)時間延長，肝臟內(nèi)中性粒細(xì)胞的聚集程度明顯增加，見表3。②肝臟濕干比的變化顯示膽總管結(jié)扎組較假手術(shù)組術(shù)后不同時間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，肝臟組織的水腫于21 d時達(dá)高峰，見表3。

表2血清透明質(zhì)酸和肌酐的變化(±s，n=6)Tab 2 Changes of serum hyaluronic acid and serum creatinine in obstructive jaundice group and sham operation group at different time points after operation(±s，n=6)

表2血清透明質(zhì)酸和肌酐的變化(±s，n=6)Tab 2 Changes of serum hyaluronic acid and serum creatinine in obstructive jaundice group and sham operation group at different time points after operation(±s，n=6)

同時間點(diǎn)與假手術(shù)組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;同組與術(shù)后1 d比較，##P ＜0.01

術(shù)后天數(shù) HA/(ng/ml)SM組 OJ組Cr/(mmol/L)SM組 OJ組1 d 157.28 ±18.12 213.45 ±10.25* 1.49 ±0.23 2.07 ±0.15*3 d 78.99 ±9.24## 256.19 ±18.20＊＊ 1.29 ±0.05 2.51 ±0.24*7 d 83.03 ±9.44## 229.82 ±32.39＊＊ 1.24 ±0.08 2.33 ±0.20*14 d 71.87 ±15.78## 236.68 ±20.38＊＊ 1.28 ±0.11 2.32 ±0.13*21 d 88.25 ±16.82## 449.74 ±66.65＊＊## 1.26 ±0.20 2.25 ±0.12*

表3肝臟組織髓過氧化物酶和濕干比的變化(±s，n=6)Tab 3 Changes of myeloperoxidase in liver tissue and ratio of wet and dry weight of liver in obstructive jaundice group and sham operation group at different time points after operation(±s，n=6)

表3肝臟組織髓過氧化物酶和濕干比的變化(±s，n=6)Tab 3 Changes of myeloperoxidase in liver tissue and ratio of wet and dry weight of liver in obstructive jaundice group and sham operation group at different time points after operation(±s，n=6)

同時間點(diǎn)與假手術(shù)組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

術(shù)后天數(shù) MPO(U/g)SM組 OJ組W/D SM組 OJ組1 d 0.57 ±0.08 0.87 ±0.05* 2.71 ±0.21 3.14 ±0.25*3 d 0.59 ±0.09 1.31 ±0.17＊＊ 2.81 ±0.16 3.12 ±0.04*7 d 0.61 ±0.09 1.44 ±0.16＊＊ 2.79 ±0.05 3.20 ±0.15*14 d 0.64 ±0.06 1.50 ±0.18＊＊ 2.66 ±0.12 3.27 ±0.11*21 d 0.60 ±0.08 1.62 ±0.19＊＊ 2.69 ±0.10 3.64 ±0.17*

2.4 光鏡觀察 ①HE染色:膽管梗阻急性期(術(shù)后1 d)可見肝臟充血水腫明顯;其后早期肝細(xì)胞濁腫，水樣變性或脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)少見膽色素顆粒，小膽管內(nèi)不見膽栓形成，匯管區(qū)無明顯改變。隨梗阻時間延長，肝細(xì)胞變性較前為重，部分肝細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞內(nèi)可見膽色素沉著、枯否細(xì)胞增生、匯管區(qū)水腫、小膽管增生明顯，管腔內(nèi)可見膽栓形成，匯管區(qū)可見明顯炎癥細(xì)胞浸潤及纖維組織增生。肝臟纖維化程度于術(shù)后21 d時肝臟纖維化最重。②假手術(shù)組各時間點(diǎn)肝組織內(nèi)中性粒細(xì)胞聚集程度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，故未將SM各組數(shù)據(jù)列出，而將其作為一整體與OJ各組進(jìn)行比較(見表4)。數(shù)據(jù)顯示膽總管結(jié)扎組術(shù)后1 d中性粒細(xì)胞數(shù)即有增高，隨著時間的延長膽總管結(jié)扎組中性粒細(xì)胞較假手術(shù)組明顯增高。

2.5 相關(guān)分析 膽總管結(jié)扎組血清透明質(zhì)酸的變化分別與肝臟組織內(nèi)髓過氧化物酶含量、中性粒細(xì)胞聚集程度呈正相關(guān)性(分別相關(guān)系數(shù)r=0.469，P=0.009，雙側(cè);r=0.398，P=0.03，雙側(cè))。

3 討論

梗阻性黃疸后肝臟微循環(huán)障礙涉及對肝竇內(nèi)皮細(xì)胞功能的評價，近年的研究顯示通過血清透明質(zhì)酸的變化可反映該細(xì)胞的功能改變［8，9］。血清透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)是一種沒有支鏈結(jié)構(gòu)的高分子量黏多糖，由間質(zhì)細(xì)胞合成，廣泛存在于全身結(jié)締組織中，代謝產(chǎn)生的HA可經(jīng)淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液循環(huán)。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞表面有HA受體，是清除血液中HA的主要部位，血清中的HA可特異性地被肝竇內(nèi)皮細(xì)胞攝取和降解［10］，少量小分子由腎小球?yàn)V過。因此，HA的改變可用以反映肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的功能，顯示肝臟微循環(huán)損傷狀況［11］。

表4肝組織內(nèi)中性粒細(xì)胞聚集程度(±s)Tab 4 Accumulation of polymorphonuclear leukocyte(PMN)in hepatic tissue in obstructive jaundice group and sham operation group at different time points after operation(±s)

表4肝組織內(nèi)中性粒細(xì)胞聚集程度(±s)Tab 4 Accumulation of polymorphonuclear leukocyte(PMN)in hepatic tissue in obstructive jaundice group and sham operation group at different time points after operation(±s)

與假手術(shù)組相比，＊＊P ＜0.01

組別 n PMN聚集程度(個/50HP)SM組30 32.40 ±4.69 OJ1 組 6 87.33 ±11.27＊＊OJ3 組 6 207.50 ±25.74＊＊OJ7 組 6 246.33 ±11.13＊＊OJ14 組 6 251.67 ±23.17＊＊OJ21 組 6 247.33 ±20.96＊＊

膽總管結(jié)扎組術(shù)后1 d血清HA及轉(zhuǎn)氨酶增高迅速，肝臟出現(xiàn)充血，水腫，有片狀壞死等急性改變;而假手術(shù)組早期血清HA明顯升高(1 d)，其后快速下降并穩(wěn)定在較低水平?？梢?，HA早期快速升高一次性膽管完全梗阻所造成的急性肝臟損傷以及手術(shù)創(chuàng)傷有關(guān)。膽總管完全結(jié)扎后3 d開始，血清透明質(zhì)酸逐步增高，反映膽道完全梗阻后早期即可影響肝竇內(nèi)皮細(xì)胞功能變化［12］。長時間的膽道梗阻(21 d)，大鼠血清透明質(zhì)酸明顯增高，并與梗阻性黃疸后肝臟纖維化程度相紊合。研究表明肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在肝臟纖維化過程中亦起一定的作用，表現(xiàn)為肝竇內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管化，并大量合成HA，因此臨床中可檢測血清 HA，用于肝纖維化的早期診斷［13］。本研究顯示梗阻性黃疸發(fā)生過程中，HA的變化趨勢與Cr的變化之間不具有相關(guān)性，其變化主要反映肝臟竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷的狀況。

髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)存在于中性粒細(xì)胞的嗜天青顆粒中，約占細(xì)胞干重的5%，通過測定組織內(nèi)MPO含量可用于推斷組織中中性粒細(xì)胞的聚集程度。本實(shí)驗(yàn)通過測定肝臟組織中髓過氧化物酶的含量，以及結(jié)合形態(tài)學(xué)上觀察肝臟組織中中性粒細(xì)胞的聚集程度，顯示膽總管結(jié)扎組血清透明質(zhì)酸的變化分別與肝臟組織內(nèi)髓過氧化物酶含量、中性粒細(xì)胞聚集程度呈正相關(guān)性，表現(xiàn)為隨著梗阻時間的延長，肝臟組織內(nèi)中性粒細(xì)胞聚集程度增加，表明肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與膽道梗阻導(dǎo)致的活化的中性粒細(xì)胞聚集有關(guān)。

梗阻性黃疸過程中因內(nèi)毒素血癥的出現(xiàn)［14］，會使枯否細(xì)胞激活并產(chǎn)生一些前炎癥因子，如TNF-α、IL-6等，這些前炎癥因子將刺激中性粒細(xì)胞趨化因子和激活調(diào)節(jié)因子(IL-8、及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化因子(cytokine-induced neutrophil chemoattractant，CINC)的釋放［15］。加之，肝內(nèi)膽管擴(kuò)張，竇壁細(xì)胞腫脹，血管收縮和舒張物質(zhì)失平衡以及PMN變形能力低下等原因均有利于中性粒細(xì)胞在肝臟中聚集，該細(xì)胞在細(xì)胞因子、黏附分子等調(diào)控下，細(xì)胞在肝竇內(nèi)滾動、黏附、滲出，并釋放炎癥因子、水解蛋白以及氧自由基等物質(zhì)，導(dǎo)致肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而加重肝臟損傷程度［16］。

綜上，本研究認(rèn)為梗阻性黃疸后血清HA的早期明顯增高，可反映了肝臟內(nèi)皮細(xì)胞功能的早期改變，而中性粒細(xì)胞在肝臟內(nèi)大量聚集是導(dǎo)致梗阻性黃疸肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并致微循環(huán)障礙的主要原因。

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