華勇謀　雷莉輝　胡 平　曹授俊　關(guān)文怡 （北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系　102442）

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離心條件對犬精液冷凍保存精子活率的影響

華勇謀雷莉輝胡 平曹授俊*關(guān)文怡 （北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系102442）

通過手握法，采集的精液匯集，分成3等份，分別用3種離心條件離心。對離心后的精液進行稀釋冷凍。解凍后保存在37℃水浴中，0~6h測定精子活率、對精子活力進行評估。結(jié)果表明，解凍后放入37℃水浴中，立即檢查，3種離心處理組在0h精子活力、活率差異不顯著(P＞0.05)。精子活力、精子活率隨保存時間的增加明顯下降(P＜0.05)，3組之間變化差異不顯著(P＞0.05)。

犬 離心 精液 冷凍保存 精子活率

犬精液冷凍保存技術(shù)在犬種資源的保護、品種選育和加快良種進程等方面都能發(fā)揮關(guān)鍵作用。自1780年，意大利生理學(xué)家SpMlanzani首次用犬進行了人工授精(AI)試驗后。Harrop首次對犬的凍精AI進行了試驗并獲得成功[1]。1965年Harrop和BendorfK等人以牛奶和卵黃-檸檬酸緩沖液稀釋犬精液，在5℃條件下精子存活了數(shù)天。我國在這方面的起步較晚，目前尚處于試驗研究階段，潘壽文等(1986)、王力波等(1991)、禹學(xué)禮等(1997)對犬精液的冷凍保存進行了研究。犬冷凍精液的技術(shù)水平還比較低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于發(fā)達(dá)國家。

研究發(fā)現(xiàn)精清中含有磷脂酶或類磷脂酶等許多物質(zhì)，這些物質(zhì)對精子，尤其對冷凍后精子的品質(zhì)有十分不利的作用[2]。J.M.Cartel在第七屆國際家畜繁殖和人工授精會議上首次提出用沖洗離心的方法處理精液，來減少磷脂酶或類磷脂酶對精子的影響[3]。1999 年我國建立了波爾山羊的細(xì)管精液冷凍程序，試驗中用離心除去精清，加入卵黃稀釋液，乙二醇作保護劑，獲得了良好的冷凍效果[4]。目前未見離心處理在犬精液低溫保存中應(yīng)用，為明確離心轉(zhuǎn)速對犬精子低溫保存的影響，為更好的保存精液，獲得高質(zhì)量的精子而進行了本試驗，研究4種離心條件對精液冷凍保存后精子活力、精子活率的影響。

1 試驗材料

1.1 試驗動物

5只成熟、有生育能力、健康的公犬，年齡2~6歲。飼喂商品犬糧(冠能)，自由飲水，圈養(yǎng)，每日自由活動2次。開始實驗前，訓(xùn)練手握法采精。

1.2 藥品

（1）三羥甲基氨基甲烷(Tris Base)：Promega Corporation U.S.A.。（2）檸檬酸:北京化學(xué)試劑公司。（3）葡萄糖：北京化學(xué)試劑公司。（4）甘油：北京化學(xué)試劑公司。（5）卵黃：新鮮雞蛋(北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧場)。（6）青霉素鈉：華北制藥股份有限公司。（7）硫酸鏈霉素：華北制藥股份有限公司

2 試驗方法

2.1 精液采集

利用手握法采精犬的精液，只收集第1、2兩部分，第3部分遺棄。采集的精液匯集到一起，保存在37℃水浴中。分成4等份，3份分別用3種離心條件離心，1份作為對照。

2.2 精液質(zhì)量測定

通過測定精液冷凍-解凍后保存在 37℃水浴中，0~6h測定精子活力、精子活率。

2.3 精液冷凍保存

2.3.1 精液冷凍稀釋液 （1）A液：Tris2.4g、檸檬酸1.4g、葡萄糖0.8g、青霉素0.06g、硫酸鏈霉素0.1g、20卵黃、加蒸餾水至100ml。（2）B液：Tris2.4g、檸檬酸1.4g、葡萄糖0.8g、青霉素0.06g、硫酸鏈霉素0.1g、12ml甘油、20卵黃、加蒸餾水到100ml。

2.3.2 精液處理 （1）離心：將匯集的精液分成3等分，分別在1000/min×5min，2000/min×5min，3000/min× 5min 3種離心條件離心。（2）稀釋平衡：棄掉上層液體(留下0.1ml左右的精清)，用稀釋液A液稀釋沉淀的精子，稀釋后精子密度為2億/ml。稀釋液的溫度和精液的溫度相同(37℃左右)。37℃水浴5min后，加入等體積的稀釋液B稀釋，等溫稀釋后的精液，用4層紗布包裹置于4℃冰箱中降溫40min。

2.3.3 精液冷凍與解凍 將平衡后的精液在4℃環(huán)境中吸到0.5ml的冷凍管中，封口，在液氮罐口降溫熏蒸后投入液氮罐中，37℃水浴解凍，將精液倒進有蓋的小離心管中，放在37℃水浴中保存6h。解凍后的精液在第0、2、4和6h進行質(zhì)量評估。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 4次重復(fù)實驗，數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計軟件進行平均數(shù)和方差分析統(tǒng)計，用q法進行多重比較。

3 試驗結(jié)果

見附表。

附表 精液冷凍解凍后0~6h精子活率 (%，Mean±Sd，n=4)

組別0h2h4h6h 1000r/min×5min59.5±4.028.5±3.8a17.9±2.36.6±2.5b 2000r/min×5min57.8±6.125.0±3.6b16.7±3.45.1±2.3b 3000r/min×5min61.3±4.922.3±2.6c15.0±3.810.2±2.5a

注：同列間不同肩標(biāo)，a、b、c表示差異顯著(p<0.05)。

解凍后放入37℃水浴中，立即檢查精液質(zhì)量。1000r/min×5min，2000r/min×5min，3000r/min×5min三種離心處理組的活率分別為59.5±4.0%，57.8±6.1%，61.3± 4.9%，差異不顯著(P＞0.05)?；盥孰S保存時間的增加明顯下降(P＜0.05)，保存2h時，精液采用1000r/min×5min的離心方式，精子活率較高(P<0.05)，保存6h時，精液采用3000r/min×5min的離心方式，精子活率較高(P<0.05)。

4 討論

用于冷凍的精液必須符合質(zhì)量要求，從精液的采集到精液的解凍任何操作都會影響冷凍結(jié)果。本試驗用3種離心條件對同一份犬的精液進行處理，其它條件都相同，解凍后精液放入37℃水浴中保存6h，每2h進行1次精液精子活率質(zhì)量檢查，精子活率隨水浴保存時間的增加而快速下降，0~2h間最為顯著(P＜0.05)。3組之間活率和活力從0到6小時間變化差異不顯著(P＞0.05)。新鮮精液精子的活率和活力分別為88.5±5.5%和80.2±4.0%，而解凍后0h的活率和活力分別接近60%和50%，解凍后的活率和活率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于新鮮精液，兩者差異顯著(P＜0.05)。

[1] Harrop AE. Artificial insemination of a bitch with preserved semen. Br Vet J， 1954, 110: 424-425 .

[2] 馬毅, 曹斌云, 姬云濤. 山羊除精漿冷凍精液的研究進展[J]. 國外畜牧科技, 2001, (4):33-35.

[3] 徐鐵錚. 家畜冷凍精液(第3版)[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社, 1997.

[4] 趙曉娥, 王光亞, 馬保華. 布爾山羊細(xì)管冷凍精液研制初報[J]. 西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1999 (2): 19-22.

（2011–06–15）

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