張譯元 常維山 （山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 泰安 271000）

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水貂α-干擾素基因的克隆、測序與遺傳進(jìn)化分析

張譯元 常維山*（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 泰安 271000）

根據(jù)GenBank發(fā)表的序列，應(yīng)用DNAstart分析軟件設(shè)計(jì)并合成一對引物用于擴(kuò)增水貂α干擾素(IFN-α)基因，從病死水貂的脾臟中提取總RNA，RT-PCR擴(kuò)增水貂α干擾素基因，獲得了約564bp片段，將其克隆到pEasy-T1載體中，進(jìn)行序列分析，證實(shí)該基因是水貂α干擾素基因。將測序結(jié)果與GenBank發(fā)表的水貂的IFN-α基因序列進(jìn)行比較，核苷酸序列同源性為94.3%~95.5%，氨基酸序列同源性為89.3%~91.4%。同時(shí)將核苷酸序列、氨基酸序列與其他幾種犬科動物進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，其同源性分別在78.1%~99.3%之間和69.4%~100.0%之間。

水貂 IFN-α基因 克隆測序 遺傳進(jìn)化

干擾素(Interferon, IFN)是一類能誘導(dǎo)動物細(xì)胞產(chǎn)生多種廣譜抗病毒蛋白的細(xì)胞因子，具有阻止病毒繁殖、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)的生物學(xué)功能，是應(yīng)用前景廣闊的重要生物制劑之一[1,2]。干擾素分為I型和II型兩類。I型干擾素包括IFN-α和IFN-β等，II型干擾素又稱免疫干擾素即IFN-γ。80年代中期，人的干擾素基因克隆成功，抗病毒與抑制腫瘤的效果十分顯著[3]。隨后，犬、豬、貓和雞的干擾素基因相繼克隆成功[4]，并正在向臨床應(yīng)用過渡[5~8]。我國于90年代初開始了人干擾素的研究，接著畜、禽干擾素的研究相繼展開，而犬科動物干擾素的分子生物學(xué)研究報(bào)道還很少。

近年來，貂、狐貍、貉等犬科動物作為特種經(jīng)濟(jì)動物飼養(yǎng)正在興起。而犬科動物各種病毒性疾病是造成死亡的最重要原因。干擾素對病毒具有廣譜、特效的抗病毒感染作用[9]。所以，為進(jìn)行犬科動物干擾素制劑的研究，本實(shí)驗(yàn)對水貂IFN-α進(jìn)行克隆、序列分析及遺傳進(jìn)化分析。該實(shí)驗(yàn)不僅為重組水貂干擾素的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，而且分析了針對一種犬科動物的干擾素是否適用于所有犬科動物，為臨床治療及飼養(yǎng)管理提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 水貂脾臟采自諸城某水貂養(yǎng)殖場。質(zhì)粒和細(xì)菌：pEasy-T1載體構(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司，大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。酶及試劑：RT-PCR試劑盒、TaqHiFi DNA聚合酶購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，TRIzol細(xì)胞裂解液購自Invitrogen公司，質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化膠回收試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上發(fā)表的雪貂IFN-α基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對引物：F:5￠-TAGAATTCAT GGCCCTGCCCTGCTC-3￠，R:5￠-GCTCTAGACTTCCTGC TCCGCAATCT-3￠，分別添加ECOR1、Xba1酶切位點(diǎn)，下游引物去掉終止密碼子后由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3 水貂脾臟總RNA的提取 稱取0.1g水貂脾臟，碾磨器中按每0.1g組織加入1mlTRIzol細(xì)胞裂解液，充分碾磨達(dá)勻漿狀態(tài)，室溫靜置5min，加入200ml氯仿，劇烈震蕩30s，室溫孵育3min，12000g/min，4℃離心10min。小心吸取上清，加入500ml異丙醇，室溫孵育10min，10000g/mim，4℃離心10min。棄去上清，加入1ml75%乙醇(DRPC處理的水配置)，10000g/min，4℃離心5min。棄去上清，室溫晾干沉淀(大約5min)，沉淀溶于50~100ml RNA溶解液中，55~60℃孵育10min，即獲得水貂脾臟總RNA。

1.4 水貂IFN-α基因的擴(kuò)增與序列分析 采用RT-PCR方法擴(kuò)增目的基因，操作步驟：AMV Buffer4ml、模板RNA2ml、dNTP8ml、RNase inhibition 0.5ml、3￠-primer 2ml、AMV0.5ml充分混勻后置PCR儀上25℃5min、42℃60min、85℃5min滅活A(yù)MV反轉(zhuǎn)錄酶，冷卻后直接用于PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：Buffer2.5ml、dNTP2ml、模板1ml、5￠-primer0.5ml、3￠-primer0.5ml、TaqHiFi0.2ml、無菌水18.3ml，充分混勻后置于PCR儀上，94℃預(yù)變性5min，94℃40s，60℃50s，72℃50s，30個循環(huán)后72℃延伸7min，擴(kuò)增完畢后，取5ml于0.8%瓊脂糖凝膠電泳中觀察結(jié)果。用膠回收試劑盒回收與理論值大小相同的基因片段，構(gòu)建PEasy-T1-IFNα克隆。經(jīng)PCR及酶切初步鑒定后，送金斯瑞生物科技有限公司測序。測序成功后用DNAstart軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 水貂IFN-α基因的擴(kuò)增結(jié)果 從水貂脾臟中提總RNA，用RT-PCR方法擴(kuò)增出一條564bp的條帶，其大小與預(yù)期的結(jié)果相一致(見圖1)。

圖1 水貂α干擾素RT-PCR產(chǎn)物電泳分析

1：RT-PCR產(chǎn)物 2：PCR Marker

2.2 水貂干擾素基因的克隆與鑒定 將目的基因克隆于PEasy-T1載體，對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切鑒定，得到的結(jié)果與預(yù)期的結(jié)果相一致(見圖2、圖3)。

圖2 PCR鑒定結(jié)果

1:PCR Marker 2:PCR產(chǎn)物

圖3 酶切鑒定結(jié)果

1:PEasy-T1-IFNα酶切鑒定 2:PCR Marker

2.3 序列分析與比較 測序結(jié)果顯示的目的片段大小為561bp，編碼186個氨基酸。將水貂IFN-α基因序列與GenBank上收錄的雪貂(EU863613.1)核苷酸同源性為94.3%，氨基酸同源性為89.3%；與雪貂(EU863614.1)核苷酸同源性為95.0%，氨基酸同源性為90.9%；與雪貂(EU863615.1)核苷酸同源性為95.5%，氨基酸同源性為91.4%(見表1)。該質(zhì)粒被命名為pEasy-T1-MIFNα。

表1 IFN-α基因序列及氨基酸序列的同源性比較

2.4 IFN-α基因的遺傳進(jìn)化分析

表2 IFN-α基因序列同源性比較

注：1~10分別代表雪貂(序列號：EU863613.1、EU863614.1、EU863615.1)、大熊貓(序列號：DQ392973.1)、犬(序列號：M28624.1、HQ680864.1)、貉(EF543192.1)、赤狐(序列號：EF990625.1、EF543191.1)、本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的基因序列。

由表2可以看出雪貂、大熊貓、犬、、貉、赤狐的IFN-α核苷酸序列同源性在78.1%~99.3%之間。氨基酸同源性在66.3%~98.4%之間。犬和赤狐的IFN-α親緣關(guān)系最近(同源性接近98.0%)，犬和貉的IFN-α親緣關(guān)系也比較最近(同源性達(dá)98.0%)，而水貂和赤狐、貉、犬的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)(基因同源性79.1%左右，氨基酸同源性66.3%~67.9%)。

2.5 IFN-α基因的進(jìn)化樹

圖4 IFN-α基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

近年來，犬科動物的飼養(yǎng)已越來越多，而犬細(xì)小病毒病、犬瘟熱和犬腺病毒等病毒病卻嚴(yán)重危害著犬的健康和生存[10]，病毒病的預(yù)防和治療顯得尤為重要。目前國內(nèi)主要采用犬五聯(lián)弱毒疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防，由于母源抗體的干擾及毒株的抗原漂移，常導(dǎo)致免疫失敗，因此研制安全高效的干擾素抗病毒制劑具有重大意義[11]。為了研究犬科動物α干擾素的生物學(xué)活性，對其全基因序列與遺傳進(jìn)化進(jìn)行分析具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR方法擴(kuò)增得到了約564bp目的片段，經(jīng)T載體克隆和測序分析表明，證實(shí)為水貂I型INF-α，生物學(xué)信息分析表明水貂IFN-α基因序列與GenBank上收錄的雪貂(EU863613.1)核苷酸同源性為94.3%，氨基酸同源性為89.3%；與雪貂(EU863614.1)核苷酸同源性為95.0%，氨基酸同源性為90.9%；與雪貂(EU863615.1)核苷酸同源性為95.5%，氨基酸同源性為91.4%。

通過幾種犬科動物的IFN-α基因的核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，IFN-α的同源性分別為78.1%~ 99.3%之間和66.3%~98.4%之間。從構(gòu)建進(jìn)化樹的結(jié)果來看，狐、貉、犬的遺傳距離較近，在進(jìn)化關(guān)系上可能具有密切的親緣關(guān)系。水貂INF-α基因和赤狐、貉、犬的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)(基因同源性79.1%左右，氨基酸同源性66.3%~67.9%)，與大熊貓的親緣關(guān)系卻比較近，因此犬的干擾素可能對水貂不適用。

雖然各犬科動物雖然在生理外形上有很多相近和相似的地方，但從該實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)的有限數(shù)據(jù)中，干擾素基因不能體現(xiàn)它們在遺傳進(jìn)化過程中的親源關(guān)系。

有關(guān)研究表明，將細(xì)胞因子基因與保護(hù)性抗原基因共同構(gòu)建或共表達(dá)而研制成的基因工程制劑，是提高機(jī)體免疫效力和降低部分病原體毒性的有效手段之一[12]。本研究對幾種犬科動物的干擾素基因進(jìn)行了序列比較、同源性分析和遺傳進(jìn)化分析，下一步將研究用一種犬科動物來源的IFN-α能否防治多種犬科動物的病毒性疾病。

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（2011–09–15）

S813.3

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1007-1733(2011)10-0003-03