李穎暢 馬 勇 樊 嚴(yán) 劉麗萍

(渤海大學(xué)生物與食品科學(xué)學(xué)院1,錦州 121000)

(錦州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)所2,錦州 121000)

大孔樹(shù)脂吸附薯蔓黃酮條件優(yōu)化及其清除氧自由基能力

李穎暢1馬 勇1樊 嚴(yán)2劉麗萍1

(渤海大學(xué)生物與食品科學(xué)學(xué)院1,錦州 121000)

(錦州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)所2,錦州 121000)

比較了 7種大孔樹(shù)脂對(duì)薯蔓黃酮的吸附和解吸效果,研究了 HPD-600大孔樹(shù)脂對(duì)薯蔓黃酮的純化工藝參數(shù)及其對(duì)氧自由基的清除能力。結(jié)果表明,HPD-600大孔樹(shù)脂是純化薯蔓黃酮比較好的樹(shù)脂;薯蔓黃酮在 HPD-600樹(shù)脂上的吸附平衡時(shí)間為 3.5 h,解吸平衡時(shí)間為 2.0 h;吸附的最適質(zhì)量濃度為6.08 mg/L;解吸時(shí)宜選用體積分?jǐn)?shù) 60%乙醇溶液。該工藝生產(chǎn)的黃酮產(chǎn)品為黃色粉末,回收率為 81.36%,純度為 77.58%。薯蔓黃酮具有清除氧自由基的能力,清除羥自由基的 I C50為 314.79μg/mL,清除超氧陰離子的 I C50為 326.92μg/mL。

薯蔓黃酮 大孔樹(shù)脂 吸附 氧自由基

甘薯為旋花科甘薯屬植物,薯蔓 (通稱紅薯藤,即甘薯地上部分的葉、柄、藤)資源量巨大,營(yíng)養(yǎng)豐富,但目前對(duì)其缺乏開(kāi)發(fā)利用,一般都作為廢棄物拋棄,造成浪費(fèi)和污染。薯蔓中不僅含有蛋白質(zhì)、氨基酸、胡蘿卜素、維生素、礦物質(zhì),而且富含黃酮類化合物。黃酮類化合物具有防治心血管疾病、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、提高免疫力等作用[1]。專家和學(xué)者非常重視黃酮類化合物,并在積極尋找廉價(jià)、高效的黃酮資源[2-4]。目前對(duì)薯蔓黃酮的研究主要集中在提取和生理功能方面[5-6],對(duì)薯蔓黃酮的純化研究較少。大孔吸附樹(shù)脂是近 10年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一類有機(jī)高分子聚合物吸附劑,具有吸附容量大、吸附速度快、選擇性好、再生簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),因而被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離純化[7]。本文選用 7種不同類型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)薯蔓黃酮粗提物進(jìn)行吸附解吸,從中篩選出較為適合薯蔓黃酮分離純化的樹(shù)脂,優(yōu)化大孔樹(shù)脂分離純化薯蔓黃酮的工藝,并通過(guò)體外化學(xué)模擬研究其對(duì)氧自由基的清除作用,旨在變“廢”為寶,為充分高效利用薯蔓資源以及提高甘薯附加值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薯蔓:遼寧省錦州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,10月份采收;蘆丁 (生化試劑):中國(guó)藥品生物制品檢定所;乙醇:北京化學(xué)試劑公司;鹽酸、氫氧化鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、石油醚:沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠;亞硝酸鈉、硝酸鋁、水楊酸、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、鄰苯三酚、三羥基氨基甲烷 (Tris)、乙二氨四乙酸二鈉:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;S-8:天津南開(kāi)大學(xué)化工廠;HPD-100、HPD-450、HPD-600:河北滄州寶恩化工有限公司 ;AB-8、DA-201、DM-301:天津海光有限公司。

7200型可見(jiàn)分光光度計(jì):上海尤尼柯有限公司;UV-1600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):北京瑞利分析儀器公司;RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海博通經(jīng)貿(mào)有限公司;SHZ-III B型循環(huán)水真空泵:上海華琦科學(xué)儀器有限公司;HZQ-F全溫振蕩培養(yǎng)箱:哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;DZF-6050型真空干燥箱:上海精宏儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 薯蔓黃酮粗提物的制備

取一定量薯蔓 60℃烘干,粉碎后過(guò) 40目篩,用體積分?jǐn)?shù) 60%乙醇溶液按 1∶20(g/mL)的比例混合均勻,于 50℃下浸提 2 h后抽濾,收集濾液,50℃減壓濃縮,經(jīng)石油醚脫脂。

1.2.2 工作曲線回歸方程的建立

精密稱取蘆丁對(duì)照品 200 mg,用體積分?jǐn)?shù) 70%乙醇溶解,定容至 100 mL容量瓶中。精密移取12.5 mL蘆丁液于 50 mL容量瓶中,用蒸餾水定容,得到 0.5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL,分別置于 25mL容量瓶中 ,加質(zhì)量分?jǐn)?shù) 5%NaNO2溶液 1 mL,放置 6 min后,加質(zhì)量分?jǐn)?shù) 10%硝酸鋁溶液 1 mL,放置 6 min,再加質(zhì)量分?jǐn)?shù) 4%NaOH 10 mL,加蒸餾水至刻度,搖勻,放置15 min,進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,在 500 nm處有最大吸收波長(zhǎng)。以測(cè)定結(jié)果得蘆丁濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=10.93X-0.006(X:濃度,mg/mL;Y:吸光值),R=0.999 4。

1.2.3 最佳樹(shù)脂類型的篩選

樹(shù)脂預(yù)處理:7種大孔樹(shù)脂分別用無(wú)水乙醇浸泡24 h,充分溶脹,用無(wú)水乙醇淋洗至洗出液加適量水無(wú)白色渾濁現(xiàn)象為止,再用蒸餾水洗至無(wú)醇,吸干樹(shù)脂中水分。

樹(shù)脂吸附率和解吸率的測(cè)定:準(zhǔn)確稱取預(yù)處理大孔樹(shù)脂 2 g,置于 100 mL三角瓶中。加入 50 mL一定濃度黃酮溶液,置振蕩器上 30℃、110 r/min振蕩吸附 24 h后,測(cè)定黃酮溶液的濃度。用蒸餾水洗去殘余黃酮后吸干水分,然后加入體積分?jǐn)?shù) 60%乙醇25 mL,置振蕩器上于 30℃、110 r/min下振蕩 24 h,充分解吸后過(guò)濾,測(cè)定濾液黃酮濃度。

式中:α為吸附率/%;C0為黃酮溶液初始濃度/mg/mL;C1為吸附平衡后黃酮溶液濃度/mg/mL;Qa為吸附量/mg/g;Va為黃酮溶液體積/mL;W為樹(shù)脂質(zhì)量/g;Qd為解吸量,mg/g;Cd為解吸液濃度,mg/mL;Vd為解吸液體積,mL;β為解吸率 /%。

1.2.4 薯蔓黃酮在 HPD-600樹(shù)脂上吸附平衡時(shí)間的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取已預(yù)處理的大孔樹(shù)脂 2.00 g.置于100 mL三角瓶中。加入 50 mL黃酮溶液,置振蕩器上于 30℃、110 r/min下振蕩,每隔 30 min測(cè)定一次吸附量,計(jì)算樹(shù)脂對(duì)薯蔓黃酮吸附量與時(shí)間的關(guān)系。

1.2.5 薯蔓黃酮在 HPD-600樹(shù)脂上解吸平衡時(shí)間的測(cè)定

稱取吸附薯蔓黃酮飽和樹(shù)脂 2.00 g,加入體積分?jǐn)?shù) 60%乙醇溶液 25 mL,置振蕩器上于 30℃、110 r/min下振蕩,每 30 min測(cè)定一次解吸量,計(jì)算樹(shù)脂對(duì)薯蔓黃酮解吸量與時(shí)間的關(guān)系。

1.2.6 薯蔓黃酮濃度對(duì) HPD-600樹(shù)脂吸附的影響

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理的大孔樹(shù)脂若干份,每份2.00 g,置于 100 mL三角瓶中,加入不同質(zhì)量濃度的黃酮溶液各 50 mL,置于振蕩器上 110 r/min下振蕩4.5 h,待吸附平衡后測(cè)定溶液的平衡質(zhì)量濃度,并計(jì)算吸附率,吸附量。

1.2.7 乙醇濃度對(duì) HPD-600樹(shù)脂解吸的影響

分別取吸附薯蔓黃酮飽和的樹(shù)脂 2 g,分別加入體積分?jǐn)?shù)為 20%、40%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液 25 mL,30℃、110 r/min下振蕩 2.0 h,測(cè)定洗脫液中黃酮溶液濃度,計(jì)算解吸量。

1.2.8 薯蔓黃酮回收率和純度測(cè)定[7]

將一定濃度的 50 mL粗提液注入盛有 2.00 g樹(shù)脂的三角瓶中,置振蕩器 110 r/min下振蕩 4 h,然后測(cè)定上清液的濃度 C1,用去離子水洗至流出液基本無(wú)色時(shí),加入 25 mL的洗脫劑,收集洗脫液,檢測(cè)其濃度,然后將洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,真空干燥,稱量質(zhì)量,計(jì)算后可得黃酮純度與回收率。

純度 =(X×V/G)×100%

回收率 =(X×V)/(X0×V0)×100%

式中:X為洗脫液中黃酮質(zhì)量濃度/mg/mL;V為洗脫液體積,mL;X0為黃酮液初始質(zhì)量濃度,mg/mL;V0為加入的黃酮液體積 /mL;G為洗脫液濃縮烘干后的固形物質(zhì)量 /mg。

1.2.9 清除羥自由基 (·OH)的測(cè)定[8-9]

按照 Smirnoff(1989)的方法 (有改動(dòng))。利用H2O2與 Fe2+反應(yīng)產(chǎn)生·OH,在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉并產(chǎn)生有色物質(zhì),該物質(zhì)在 510 nm下有最大吸收。反應(yīng)體系中含 8.8 mmol/L H2O21 mL,10 mmol/L FeS O41 mL,10 mmol/L水楊酸 -乙醇 1 mL,分別加入不同濃度薯蔓黃酮溶液 1 mL。最后加 H2O2啟動(dòng)反應(yīng),37℃反應(yīng) 0.5 h,以蒸餾水作參比,在 510 nm下測(cè)定各濃度的吸光度?？紤]黃酮本身的吸光值,以10 mmol/L FeSO41 mL,10 mmol/L水楊酸 -乙醇1 mL,不同濃度的薯蔓黃酮溶液 1 mL和 1 mL蒸餾水作為黃酮的本底值,抗壞血酸作陽(yáng)性對(duì)照。清除率計(jì)算公式:

清除率 =[A0-(A1-A2)]/A0×100%

式中:A0為對(duì)照液的吸光度,A1為加入黃酮溶液后的吸光度,A2為不加顯色劑 H2O2黃酮溶液的吸光度。

1.2.10 清除超氧陰離子自由基 (O2-·)的測(cè)定[9]

1.2.1 0.1 鄰苯三酚自氧化的測(cè)定

取 4.5 mLpH 8.2的 50 mmol/L Tris-HC1緩沖液,4.2 mL蒸餾水,混勻后在 25℃恒溫水浴中保溫20 min后,取出后立即加入在 25℃預(yù)熱過(guò)的3 mmol/L鄰苯三酚溶液 0.3 mL(以 10 mmol/L HCl配制,空白管用 10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚的 HCl溶液),迅速搖勻后倒入比色杯,每隔 0.5 min在320 nm處測(cè)定溶液的吸光度,計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值。

1.2.1 0.2 樣品活性測(cè)定

在加入鄰苯三酚前,先分別加入不同濃度的黃酮溶液 0.9 mL,蒸餾水減少,然后按 1.2.10.1的方法操作,抗壞血酸作陽(yáng)性對(duì)照,計(jì)算清除率。

清除率 =(△A0-△A)/△A0×100%

式中:△A0為鄰苯三酚自氧化速率;△A為加入薯蔓黃酮后鄰苯三酚的自氧化速率,單位均為吸光度每分鐘的增加值。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂對(duì)薯蔓黃酮吸附和解吸特性比較

大孔樹(shù)脂由于極性、孔徑、比表面積、孔容等不同,故理化性質(zhì)存在差異,影響其吸附分離的效果。從表 1可見(jiàn),不同類型的樹(shù)脂對(duì)薯蔓黃酮的吸附程度不同,吸附率比較高的是極性 S-8、HPD-600、非極性 HPD-100和 DM301,而解吸率比較好的是HPD-450、HPD-600、DA-201,綜合吸附率和解吸率兩個(gè)參數(shù),認(rèn)為 HPD-600型樹(shù)脂是純化薯蔓黃酮比較好的吸附樹(shù)脂,這是因?yàn)槭砺S酮是一種弱極性物質(zhì),在 HPD-600極性柱上更容易吸附,同時(shí)可能是因?yàn)楸缺砻娣e較大的原因,也較容易洗脫,純化后總黃酮含量較高,故以下試驗(yàn)重點(diǎn)考察 HPD-600型大孔樹(shù)脂對(duì)薯蔓黃酮的純化效果。

表 1 不同大孔樹(shù)脂對(duì)薯蔓黃酮靜態(tài)吸附和解吸性能

2.2 薯蔓黃酮在 HPD-600大孔樹(shù)脂上的吸附動(dòng)力學(xué)曲線

從圖 1可知,在開(kāi)始的一段時(shí)間內(nèi),HPD-600樹(shù)脂的吸附量在逐漸增加,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),吸附量逐漸達(dá)到飽和。當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)到 3.5 h以后,HPD-600樹(shù)脂對(duì)薯蔓黃酮的吸附量與 3.5 h時(shí)的吸附量差異不顯著,黃酮吸附量增加很少,吸附基本達(dá)到平衡,因此 HPD-600大孔樹(shù)脂對(duì)薯蔓黃酮的吸附時(shí)間為3.5 h。

2.3 薯蔓黃酮在 HPD-600大孔樹(shù)脂上的解吸動(dòng)力學(xué)曲線

從圖 2可知,在開(kāi)始的一段時(shí)間內(nèi),薯蔓黃酮的解吸量在逐漸增加;當(dāng)解吸時(shí)間達(dá)到 2.0 h時(shí),解吸基本達(dá)到平衡,2.0 h以后 HPD-600樹(shù)脂對(duì)黃酮的解吸量與 2.0 h時(shí)的解吸量無(wú)顯著差異,因此 HPD-600大孔樹(shù)脂對(duì)薯蔓黃酮的解吸時(shí)間為 2.0 h。

2.4 薯蔓黃酮濃度對(duì) HPD-600大孔樹(shù)脂吸附的影響

圖 3 薯蔓黃酮質(zhì)量濃度對(duì)吸附的影響

從圖 3可知,隨著黃酮溶液質(zhì)量濃度的增加,大孔吸附樹(shù)脂對(duì)黃酮的吸附率降低,吸附量逐漸增加。不同濃度的薯蔓黃酮吸附率差異顯著。濃度為 8.20和 10.30 mg/mL黃酮的吸附量差異不顯著,說(shuō)明質(zhì)量濃度為 8.20 mg/mL時(shí),黃酮吸附量已接近飽和。質(zhì)量濃度為 6.08 mg/mL、8.20 mg/mL的薯蔓黃酮溶液,吸附量的增加率差異顯著,從節(jié)約樹(shù)脂和黃酮溶液的角度考慮,最適的質(zhì)量濃度為 6.08 mg/mL。

2.5 乙醇濃度對(duì) HPD-600大孔樹(shù)脂解吸的影響

洗脫劑具有使大孔樹(shù)脂溶脹,減弱被吸附物質(zhì)與樹(shù)脂之間吸附力的作用,并可溶解被吸附物質(zhì)。由圖 4可知,乙醇濃度對(duì) HPD-600大孔樹(shù)脂純化薯蔓黃酮有較大的影響,隨著乙醇濃度的增加,薯蔓黃酮解吸量增加。乙醇體積分?jǐn)?shù)為 20%、40%時(shí),黃酮解吸量相對(duì)較低,不能將吸附的黃酮完全解吸。乙醇體積分?jǐn)?shù)為 60%、70%、80%時(shí)黃酮解吸量比較高,三者之間無(wú)顯著差異。乙醇體積分?jǐn)?shù)為 90%時(shí)黃酮解吸量略有降低,可能乙醇濃度高使一些雜質(zhì)一起洗脫下來(lái),致使醇溶液中黃酮含量降低。從節(jié)約試劑用量和黃酮純度考慮,宜選用體積分?jǐn)?shù) 60%乙醇溶液作為解吸液。

圖 4 乙醇濃度對(duì)薯蔓黃酮解吸的影響

2.6 薯蔓黃酮回收率和純度的測(cè)定

經(jīng) HPD-600大孔樹(shù)脂純化后的薯蔓黃酮為黃色粉末,采用 1.2.8計(jì)算方法對(duì)其回收率和純度進(jìn)行測(cè)定,所得的結(jié)果如表 2所示:薯蔓黃酮的回收率為 81.36%,純度為 77.58%。

表 2 薯蔓黃酮回收率和純度

2.7 薯蔓黃酮清除羥基自由基能力

羥基自由基是活性氧中最活潑的自由基,也是毒性最大的自由基[10]。它幾乎能與活細(xì)胞中任何生物大分子反應(yīng),且反應(yīng)速度極快。薯蔓黃酮具有供氫能力,H與自由基結(jié)合,使之還原為惰性化合物或是穩(wěn)定的自由基,從而可以清除機(jī)體內(nèi)過(guò)多的有害自由基。由圖 5可見(jiàn),在一定濃度范圍內(nèi),隨黃酮濃度的增大,對(duì)羥基自由基的清除率增強(qiáng),薯蔓黃酮的I C50為 314.79μg/mL?？箟难釋?duì)羥基自由基的清除能力略好于薯蔓黃酮,抗壞血酸 I C50為 46.29μg/mL(圖6)。

2.8 薯蔓黃酮清除超氧陰離子自由基能力

超氧陰離子自由基是基態(tài)氧接受一個(gè)電子產(chǎn)生的第一個(gè)氧自由基,可以經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)生成其他的氧自由基,因此對(duì)于超氧陰離子自由基的清除具有重要意義[11]。由圖 7～圖 8可知,薯蔓黃酮具有清除O2·-的作用,隨著黃酮濃度的增加,對(duì)超氧陰離子自由基的清除率也隨之提高,但薯蔓黃酮對(duì)的清除作用不如抗壞血酸,薯蔓黃酮的 IC50為326.92μg/mL,抗壞血酸 IC50為 34.45μg/mL。

圖 7 薯蔓黃酮對(duì)超氧陰離子的清除能力

圖 8 抗壞血酸對(duì)超氧陰離子的清除能力

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)對(duì) 7種大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附研究,發(fā)現(xiàn)HPD-600型大孔樹(shù)脂是一種比較理想的樹(shù)脂,吸附率大,解吸率高,較適合薯蔓中黃酮類成分的純化。3.2 HPD-600大孔樹(shù)脂對(duì)薯蔓黃酮的吸附平衡時(shí)間為 3.5 h,解吸平衡時(shí)間為 2.0 h,吸附最適質(zhì)量濃度為 6.08 mg/mL,用 60%乙醇溶液作為解吸液。經(jīng)純化后的藍(lán)莓葉黃酮為黃色粉末,回收率為81.36%,純度為 77.58%。

3.3 薯蔓黃酮具有清除氧自由基的能力,但清除羥基自由基、超氧陰離子自由基能力不如抗壞血酸;清除羥基自由基的 I C50為 314.79μg/mL,清除超氧陰離子自由基的 I C50為 326.92μg/mL。

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Adsorption Opti mization ofMacroporous Resin to Flavonoids from Sweet Potato Vines and Scavening Ability to Oxygen Free Radicals

Li Yingchang1Ma Yong1Fan Yan2Liu Liping1
(College ofBiology and Food Science,BohaiUniversity1,Jinzhou 121000)
(Institute ofBiological Technology,Jin Zhou Academy ofAgricultural Science2,Jinzhou 121000)

The characteristicsof adsorption and desorption of seven kindsofmacroporous resins to flavonoids from s weet potato vines were studied.The opti mum industrial parameters of purifying the flavonoids by macroporous resin were deter mined.The scavenging ability on oxygen free radicals of the flavonoids was evaluated.Results:HPD-600 macroporous resin is the suitable resin for purifying flavonoids from s weet potato vines,adsorption equilibrium time is 3.5 h,desorption equilibrium time is2.0 h,optimal concentration of flavonoids is6.08mg/mL,and 60%ethanol is the suitable solution for desorption of flavonoids.The product is yellow powderwith purity of 77.58%,and the desorption rate is 81.36%.The flavonoids from s weet potato vines possess scavenging ability on oxygen free radicals,the I C50of scavenging hydroxyl free radicals and superoxide anions are 314.79 and 326.92μg/mL,respectively.

flavoniods from sweet potato vines,macroporous resin,adsorption,oxygen free radicals

TS201

A

1003-0174(2011)02-0103-05

2010-01-29

李穎暢,女,1973年出生,副教授,博士,天然產(chǎn)物的功效成分