李 洋 錢 明 井宏宇 錢東華 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉林 長春 3002)

HSV-TK逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系建立及病毒滴度測定

李 洋 錢 明1井宏宇 錢東華 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉林 長春 130021)

目的 建立HSV-TK逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系并獲得高產(chǎn)病毒的細(xì)胞株。方法 將TK基因與逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體PLEGFP-N1連接后轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞PA317中，經(jīng)G418及熒光蛋白雙重篩選得到高產(chǎn)病毒的細(xì)胞株。結(jié)果 經(jīng)酶切鑒定成功構(gòu)建PlEGFP-N1-TK重組載體，含HSV-TK基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞PA317成功建立，經(jīng)病毒滴度測定獲得高產(chǎn)病毒的PA317/TK細(xì)胞株。結(jié)論 制備的重組病毒具有感染靶細(xì)胞的活性，為進(jìn)一步應(yīng)用HSV-TK基因進(jìn)行肺癌的自殺基因治療研究奠定基礎(chǔ)。

HSV-TK;逆轉(zhuǎn)錄病毒;包裝細(xì)胞PA317

惡性腫瘤的基因治療是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，其中自殺基因療法已經(jīng)成為極富希望的腫瘤治療新方法。自殺基因有多種，其中研究較多的主要有單純皰疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鳥苷(HSV-TK/GCV)和大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶基因/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)兩種自殺基因系統(tǒng)。本實驗應(yīng)用HSV-TK/GCV系統(tǒng)將TK基因與逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體PLEGFP-N1連接后轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞PA317中，經(jīng)篩選得到高產(chǎn)病毒的細(xì)胞株，為HSV-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)治療肺癌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌種和細(xì)胞株 pGEM-5Zf-HSV-TK，日本東京大學(xué)醫(yī)學(xué)部蘇肅博士慧贈;PLEGFP-N1，吉林大學(xué)第一醫(yī)院中心研究室保存;PA317細(xì)胞，購自Clontech公司;小鼠成纖維細(xì)胞(NIH3T3)細(xì)胞，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫;大腸桿菌DH5α，由東北師范大學(xué)遺傳病研究所實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒，凱基生物公司;高純度質(zhì)粒提取試劑盒，TIANGE公司;DNA片段凝膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA-Marker，TaKaRa公司;DNA測序，上海生工生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要試劑的配制 LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母抽提物5 g/L、NaCl 10 g/L、pH7.0;LA液體培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素80 μg/ml。LB平板：LB培養(yǎng)基中按15 g/L濃度加入瓊脂粉;LA平板：LA培養(yǎng)基中按15 g/L濃度加入瓊脂粉;以上均需高壓滅菌(15磅、20 min)。溶液Ⅰ：25 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)，10 mmol/L EDTA.2Na(pH 8.0)，高壓滅菌30 min，4℃冰箱中備用;溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH，10%十二烷基硫酸鈉(SDS)，室溫保存，現(xiàn)用現(xiàn)配(0.2 mol/L，1%為終濃度);溶液Ⅲ：5 mol/L乙酸鉀 300 ml，冰醋酸57.5 ml，無菌水142.5 ml，室溫下混勻，4℃冰箱中備用。

1.1.4 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱，SANYO日本;高速低溫離心機(jī)、PCR儀，美國Bio-Rad公司;DYY-Ⅲ穩(wěn)亞穩(wěn)流電泳儀、電泳槽，美國Bio-Rad公司;凝膠成像系統(tǒng)，美國IBM公司;ZF型紫外透射反射分析儀、GNP型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗技術(shù)有限公司;快速恒溫數(shù)顯水箱，常州國華電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 真核表達(dá)載體pLEGFP-N1-TK的構(gòu)建與鑒定 將載體pGEM-5Zf-HSV-TK、PLEGFP-N1 1 μl加入一管已制備好的感受態(tài)細(xì)胞中〔1，2〕進(jìn)行細(xì)菌轉(zhuǎn)化;含有 pGEM-5Zf-HSV-TK、PLEGFPN1轉(zhuǎn)化細(xì)菌大量培養(yǎng)及質(zhì)粒的提取與純化;質(zhì)粒的提取與純化，按照試劑盒說明操作。對pLEGFP-N1和pGEM-5Zf-HSVTK質(zhì)粒DNA用BglⅡ和HindⅢ分別進(jìn)行雙酶切，酶切后的plEGFP質(zhì)粒和目的DNA片段TK按1∶5摩爾比進(jìn)行連接，反應(yīng)體系10 μl：T4 DNA 連接酶1 μl，16 ℃ 過夜反應(yīng)。將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化和篩選，之后進(jìn)行重組載體的提取和鑒定，得到pLEGFP-N1-TK并進(jìn)行重組質(zhì)粒DNA的大量提取與純化。

1.2.2 PLEGFP-N1-TK重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染、克隆細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)增 用Lipofectamine2000將PLEGFP-N1-TK重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PA317細(xì)胞中，G418和倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白雙重篩選;將篩選出的克隆細(xì)胞株轉(zhuǎn)移并擴(kuò)增，轉(zhuǎn)移的細(xì)胞克隆生長相互融合達(dá)80%時，用胰酶消化后，將其轉(zhuǎn)移入25 ml培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，維持G418濃度在300 μg/ml。待細(xì)胞生長良好后，挑取生長良好的細(xì)胞株進(jìn)行傳代擴(kuò)增，用于病毒滴度測定。提取PA317和PA317/TK細(xì)胞DNA，用PCR檢測HSVTK基因整合情況。

1.2.3 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度的測定 取對數(shù)生長期的NIH3T3細(xì)胞，加含10%的小牛血清高清DMEM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml，按1 ml/孔加入24孔板中，37℃ 5%CO2培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)60%融合。將收集到的含HSV-TK基因PA317 克隆細(xì)胞的病毒上清液分別作 10-1，10-2，10-3，10-4倍稀釋;倒去NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)液體，分別吸取1.5 ml稀釋的病毒液(含polybrene 8 μg/ml)加入培養(yǎng)孔內(nèi)，不同稀釋度病毒各加 2孔，置 37℃，5%CO2條件下培養(yǎng) 3 d;更換含800 μg/ml G418的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d，其間每3～4 d換液一次。未感染病毒的NIH3T3細(xì)胞在加入等量的G418后，一般第3～5天開始死亡，第7～10天基本完全死亡;而感染病毒的NIH3T3細(xì)胞仍有細(xì)胞存活，并逐漸會有新的細(xì)胞開始生長。約2 w細(xì)胞克隆基本完成;統(tǒng)計細(xì)胞克隆數(shù)，計算病毒滴度。

病毒滴度(CFU/ml)=2瓶細(xì)胞克隆數(shù)的平均數(shù)×病毒稀釋液倍數(shù)(其中CFU為colony forming units)。

2 結(jié)果

2.1 重組載體pLEGFP-TK構(gòu)建 將pLEGFP-N1質(zhì)粒和pGEM-5Zf-HSV-TK分別以HindⅢ和BglⅡ進(jìn)行酶切，經(jīng)回收純化和連接反應(yīng)，構(gòu)建成功PlEGFP-N1-TK重組載體，行凝膠電泳。見圖1，圖2。

2.2 重組載體pLEGFP-N1-TK的酶切鑒定結(jié)果 重組質(zhì)粒分別進(jìn)行HindⅢ和BglⅡ雙酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察，結(jié)果在預(yù)期位置出現(xiàn)陽性條帶與實驗預(yù)想一致。見圖3。

2.3 含HSV-TK基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞PA317的建立

用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將載體pLEGFP-N1-TK導(dǎo)入PA317細(xì)胞，用400 μg/ml的G418篩選2 d后，細(xì)胞開始死亡;在4～5 d內(nèi)死亡達(dá)高峰;5 d后有少數(shù)細(xì)胞貼壁生長;1 w后細(xì)胞逐漸形成陽性克隆細(xì)胞團(tuán);培養(yǎng)14 d后，篩選得到陽性克隆細(xì)胞。挑取其中生長較好的抗G418及帶有綠色熒光的細(xì)胞克隆，再用含G418 800 μg/ml的低糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)一步選擇培養(yǎng)，最后形成的陽性克隆細(xì)胞命名為PA317/TK。見圖4，圖5。

2.4 PCR檢測HSV-TK基因在PA317中整合情況 經(jīng)PCR鑒定在PA317/TK細(xì)胞中檢測到完整的約1.1 kb TK基因，而未轉(zhuǎn)染TK基因的PA317細(xì)胞沒有檢測到TK基因。

2.5 PA317/TK細(xì)胞產(chǎn)病毒的滴度測定 用最終濃度800 μg/ml的G418篩選到的PA317/TK擴(kuò)大培養(yǎng)后，收集病毒液，感染NIH3T3測定病毒滴度，結(jié)果為4×104cfu/ml。

圖1 pLEGFP質(zhì)粒雙酶切圖

圖2 pGEM-5Zf-HSV-TK雙酶切

圖3 重組載體pLEGFP-N1-TK雙酶切結(jié)果

圖4 PA317/TK細(xì)胞在熒光纖維鏡下表現(xiàn)(×400)

圖5 經(jīng)篩選形成陽性克隆細(xì)胞團(tuán)(×400)

3 討論

在目前的眾多基因治療實驗中，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是被廣泛采用的載體之一〔3〕，經(jīng)過人工構(gòu)建去除其中的3個功能基因(pol，gag，env)，保留了其中的長末端重復(fù)序列(LTR)和包裝序列ψ的復(fù)制缺陷型病毒，因此它不具備感染細(xì)胞的能力。它必需與一種經(jīng)過改造的含有輔助病毒基因組的包裝細(xì)胞相互重組，將病毒RNA包裝進(jìn)去，才產(chǎn)生具有感染能力的完整病毒顆粒，此病毒顆粒能感染靶細(xì)胞，但不能復(fù)制〔4〕。PA317是逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞，其內(nèi)有逆轉(zhuǎn)錄病毒的輔助病毒基因組。因此，本文通過把帶有TK基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLEGFP-N1導(dǎo)入PA317中，建立含HSV-TK重組逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLEGFP-N1包含一個選擇標(biāo)記新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neo)，此外還有一個加強(qiáng)綠色熒光蛋白基因(green fluorescent protein，GFP)。當(dāng)PLEGFP-N1-TK導(dǎo)入PA317后通過G418及GFP篩選得到細(xì)胞陽性克隆，在抗生素G418存在的培養(yǎng)基中，沒有被導(dǎo)入PLEGFP-N1-TK的PA317細(xì)胞逐漸死亡，而導(dǎo)入PLEGFP-N1-TK的PA317細(xì)胞存活并逐漸生長，從而得到陽性細(xì)胞克隆PA317/TK。在G418篩選之前應(yīng)做預(yù)實驗，找出G418最適宜濃度，在最初篩選時應(yīng)注意G418的濃度不能過高，待細(xì)胞生長穩(wěn)定，neo基因在細(xì)胞中的表達(dá)達(dá)到一定程度時再改換高濃度的G418，以維持細(xì)胞克隆的篩選。本實驗G418的初始篩選濃度為400 μg/ml，維持細(xì)胞克隆篩選濃度為800 μg/ml。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLEGFP-N1含有GFP，所以通過倒置的熒光纖維鏡觀看被轉(zhuǎn)染的PA317發(fā)出綠色熒光來進(jìn)一步篩選陽性細(xì)胞克隆〔5〕。再通過病毒滴定度的測定挑選出產(chǎn)病毒較高的細(xì)胞株。

本實驗將HSV-TK基因克隆至逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體PLEGFP-N1，經(jīng)測TK基因序列正確后，用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞PA317，包裝后篩選出一株產(chǎn)感染性重組病毒細(xì)胞系PA317/TK，收集PA317/TK細(xì)胞培養(yǎng)上清液，再感染NI3T3細(xì)胞，測得病毒滴定度為4×104cfu/ml，從而證實了本實驗制備的重組病毒具有感染靶細(xì)胞的活性，為進(jìn)一步應(yīng)用HSV-TK基因進(jìn)行肺癌的自殺基因治療研究奠定基礎(chǔ)。

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Q344+.13

A

1005-9202(2011)16-3101-03

吉林省衛(wèi)生廳資助項目(No.1021Z031);吉林大學(xué)研究生創(chuàng)新基金(No.醫(yī)學(xué)704053)

1 吉林大學(xué)口腔醫(yī)院

錢東華(1965-)，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事肺癌及肺部感染性疾病研究。

李 洋(1979-)，女，主治醫(yī)師，博士，主要從事肺癌和哮喘的研究。

〔2011-01-29收稿 2011-03-25修回〕

(編輯 袁左鳴/徐 杰)