費(fèi) 揚(yáng)，王 慧， 凌水花， 張國(guó)慶，張祖艷

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院藥材科，上海 200438； 2.上海滬豐生物科技有限公司，上海 200433)

反相高效液相色譜法測(cè)定烏金膠囊中綠原酸的含量

費(fèi) 揚(yáng)1，王 慧1， 凌水花1， 張國(guó)慶1，張祖艷2

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院藥材科，上海 200438； 2.上海滬豐生物科技有限公司，上海 200433)

目的建立反相高效液相色譜法測(cè)定烏金膠囊中綠原酸含量，并應(yīng)用于該制劑質(zhì)量控制。方法使用Agilent extend-C18柱 (4.6 mm×250 mm,5 μm)，乙腈-0.1%甲酸(8:92)為流動(dòng)相，流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm，測(cè)定5批烏金膠囊中綠原酸含量。結(jié)果綠原酸在2.04 ～102 μg/ml(r=0.999 9)范圍內(nèi)具有良好線性。加樣回收率104.68 %，RSD=1.43%(n=6)。5批烏金膠囊中綠原酸含量在55.08～83.31 μg/g之間。結(jié)論該方法靈敏、準(zhǔn)確，適用于烏金膠囊綠原酸含量測(cè)定。

反相高效液相色譜法；綠原酸；烏金膠囊；含量測(cè)定

烏金膠囊是我院臨床用于原發(fā)性肝癌的輔助治療制劑，由烏骨藤、郁金、延胡索等5味中藥制成。該制劑功能主治：清熱解毒，活血化瘀，益氣止痛。用于癰腫痙毒、痰濕積聚、血瘀氣滯、胸脅脹痛諸癥。

烏骨藤為該制劑君藥，烏骨藤系蘿藦科牛奶菜屬植物通光藤M(fèi)arsdeniatenacissima(Roxb)WightetAm的藤莖，其性味苦，微寒，具有清熱解毒、止咳平喘、消炎鎮(zhèn)痛等功效，藥理研究表明其具有明顯的抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保肝利尿、敗毒抗癌等作用，對(duì)胃癌、肝癌等多種腫瘤具有確切的療效[1]。綠原酸是烏骨藤主要有效成分之一，具有抗癌變，抗菌，抗病毒等作用。目前烏骨藤及其制劑中綠原酸的含量測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[2，3]及高效毛細(xì)管電泳法[4]。筆者建立反相高效液相色譜法測(cè)定烏金膠囊中綠原酸含量，方法準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于烏金膠囊質(zhì)量控制。

1 儀器和試藥

1.1儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀，包括在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二級(jí)管陣列檢測(cè)器、Chemstation 色譜工作站、METYLER AE240型電子天平、超聲發(fā)生器(50KHZ.120W)。

1.2試藥 烏金膠囊由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，批號(hào)： 20100401、20100701、20100901、20101101、20110101；綠原酸對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：110753-200413；甲醇、乙腈及甲酸為色譜純 ，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Agilent extend-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸(8:92)； 流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm；進(jìn)樣量5 μl；柱溫30 ℃。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對(duì)照品10.2 mg，置10 ml容量瓶中，用50%甲醇定容，搖勻得濃度1.02 mg/ml母液，置4 ℃冰箱保存。

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱取烏金膠囊內(nèi)容物10 g，置于錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，稱定重量，浸泡15 min，超聲30 min，放冷，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減少的重量，搖勻，過濾。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 按2.1項(xiàng)的色譜條件下，以對(duì)照品溶液,樣品溶液分別進(jìn)樣，根據(jù)色譜參數(shù)計(jì)算系統(tǒng)適應(yīng)性。樣品中綠原酸保留時(shí)間是12.564 min，拖尾因子1.005，理論塔板數(shù)大于5 000，分離度大于3.0。對(duì)照品和樣品的色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品(A)和制劑樣品(B)HPLC色譜圖

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性 配制綠原酸對(duì)照品濃度為2.04、5.1、10.2、25.5、51、102 μg/ml，以色譜峰面積(Y)對(duì)對(duì)照品濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得線性方程為：Y=8.472 1X-3.415，r=0.999 9，表明綠原酸在2.04 ～102 μg /ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3檢測(cè)限及定量限 精密量取綠原酸對(duì)照品溶液適量，以信噪比3:1計(jì)，檢測(cè)限為0.68 μg/ml，以信噪比10:1計(jì)，定量限為2.04 μg/ml。

2.3.4精密度 在2.1項(xiàng)下色譜條件下，取5.1、25.5、102 μg /ml低、中、高3個(gè)濃度對(duì)照品溶液在1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，RSD分別為1.21%、0.69%和0.24%。

2.3.5穩(wěn)定性 取烏金膠囊，批號(hào)：20100901，按2.2.2項(xiàng)下制備樣品，分別考察樣品室溫放置8 h及4 ℃放置24 h測(cè)定結(jié)果，RSD均小于2%(n=3)。

2.3.6重復(fù)性 取烏金膠囊，批號(hào)：20100901，按2.2.2項(xiàng)下制備6份樣品，按2.1的色譜條件進(jìn)樣，綠原酸峰面積RSD為1.98 %。

2.3.7加樣回收率 取烏金膠囊(批號(hào)：20100901)6份，每份10 g，分別精密加入濃度為0.79 mg/ml的對(duì)照品2 ml, 按照2.1的色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為5 μl，計(jì)算回收率，平均回收率為104.68%，RSD為1.43%。

2.4樣品測(cè)定 按2.2.2制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，測(cè)定5個(gè)批次烏金膠囊，結(jié)果見表1。

3 討論

3.1提取溶劑及超聲提取時(shí)間 由于綠原酸是極性較強(qiáng)的有機(jī)酸，提取溶劑比較了純甲醇及50%甲醇超聲提取，結(jié)果50%甲醇比純甲醇提取含量高近10倍，超聲時(shí)間分別考察15、30、60 min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲30 min已能完全提取。

表1 5批烏金膠囊中綠原酸含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3.2流動(dòng)相的選擇 分別考察了水相中加0.1%磷酸及0.1%甲酸，結(jié)果顯示樣品保留時(shí)間及峰型均適宜，由于考慮到長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)樣，磷酸對(duì)系統(tǒng)影響更大，故采用乙腈-0.1%甲酸=(8:92)為流動(dòng)相。

3.3測(cè)定結(jié)果 考察了5個(gè)批號(hào)烏金膠囊中綠原酸含量，含量在55.08～83.31 μg/g之間，為制定該制劑質(zhì)量控制指標(biāo)提供參考依據(jù)。

[1] 張家俊，胡德禹 ，宋寶安，等.烏骨藤化學(xué)成分和生物活性研究進(jìn)展[J].貴州大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，3(24)： 213.

[2] 于文靜，王煥群.HPLC法測(cè)定消癌平口服液中綠原酸的含量[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2006，3(7)：50.

[3] 王月敏 ，夏素霞，于紹軍，等.烏骨藤藥材中綠原酸的含量測(cè)定方法研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2007，7(13)：12.

[4] 趙陸華，相秉仁 ，譚喜瑩.高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定烏骨藤藥材及其制劑中綠原酸的含量[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志,2008,4(25)：152.

2011-06-27

[修回日期]2011-10-20

DeterminationofchlorogenicacidcontentinwujincapsulebyRP-HPLC

FEI Yang1，WANG Hui1, LING Shui-hua1, ZHANG Guo-qing1,ZHANG Zu-yan2

(1. Department of Pharmacy, Eastern Hepatobilliary Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200438，China; 2. Shanghai Hufeng biology technology Co, Ltd , Shanghai 200433，China)

ObjectiveTo establish a RP-HPLC method for determination of chlorogenic acid in wujing capsule.MethodsAgilent extend-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)column was used. The mobile phase was acetonitrile: 0.1%formic acid (8:92). The flow rate was 1.0 ml/min, and the temperature was at 35 ℃. The detection wavelength was 327 nm. Determination of chlorogenic acid in wujin capsule of 5 batches of preparations.ResultsThe calibration curve was at the range of 2.04～102 μg/ml(r=0.999 9), and the average recovery was 104.68 %，andRSDwas 1.43%(n=6).5 batches of chlorogenic acid contents in wujin capsule were between 55.08～83.31 μg/g.ConclusionThe method was sensitive and accurate, and could be used for the quality control of wujin capsule.

RP-HPLC; chlorogenic acid; wujin capsule; content determination

費(fèi) 揚(yáng)(1982-)，女，藥師.E-mail:feiyangqy@yahoo.com.cn.

張國(guó)慶.E-mail:guoqing_zhang91@126.com.

R917

A

1006-0111(2011)06-0460-03