秦明林，張燈青，金武松

(東華大學 化學化工與生物工程學院，上海 201620)

半胱氨酸(Cys)和高半胱氨酸(Hcy)在生命體系中扮演著重要的角色，體內(nèi)缺乏會引起很多疾病[1],因此，Cys和Hcy的檢測引起了人們極大的興趣。近年來，文獻報道的探針主要是利用Cys或Hcy與主體分子間的共價作用來實現(xiàn)對其選擇性識別[2～4]，基于取代反應原理來設計Cys和Hcy的探針報道較少[5]。另外，由于比度法不用借助于任何昂貴的儀器設備直接用肉眼就能對目標分子進行識別，在近年來也引起了人們的極大興趣[6]。

8-羥基喹啉衍生物雖然被廣泛用于識別金屬離子[7，8]，但用于識別中性分子如氨基酸的報道相對較少[5，9]。設計并合成基于8-羥基喹啉衍生物且能夠?qū)崿F(xiàn)在中性緩沖水溶液中對氨基酸進行選擇性識別的探針仍是一個挑戰(zhàn)。為此，本文利用取代反應的原理，設計并合成了一種新型的8-羥基喹啉配合物[FeQ3，HQ=8-羥基-7-(4-甲苯二氮烯基)喹啉-5-磺酸](Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR和元素分析表征。利用UV-Vis和溶液顏色的變化實現(xiàn)了FeQ3對Cys和Hcy的選擇性裸眼識別。

Scheme1

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

UV 1102型紫外可見分光光度計；Bruker AV 400 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標)； Vario EL Ⅲ型O-元素分析儀。

Hcy, Acros;其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) HQ的合成： 在冰鹽浴(0 ℃～5 ℃)冷卻的反應瓶中加入4-氨基甲苯1.07 g(10 mmol)和濃鹽酸6 mL，攪拌下緩慢滴加20%NaNO2溶液20 mL，滴畢，攪拌反應至懸浮物完全變?yōu)榍辶恋狞S色溶液。滴加8-羥基喹啉-5-磺酸2.25 g(10 mmol)的Na2CO3(25 mL，4 mol·L-1)溶液,滴畢，繼續(xù)反應4 h。用鹽酸中和后過濾，濾餅用乙醇重結(jié)晶得紅色固體HQ 2.7 g，產(chǎn)率78%；1H NMRδ: 2.42(s, 3H, CH3), 7.42(d,J=8.0 Hz, 2H，ArH), 7.71(q,J=12.4 Hz, 1H，ArH), 7.91(d,J=8.4 Hz, 2H，ArH), 8.31(s, 1H, ArH), 8.94(d,J=4.0 Hz, 1H，ArH), 9.14(d,J=8.4 Hz, 1H，ArH)；13C NMRδ： 23.83, 118.77, 125.14, 126.05, 129.96, 132.79, 136.27, 137.64, 139.02, 143.36, 143.82, 151.49, 152.39, 157.49; Anal.calcd for C16H13N3O4S: C 55.97, H 3.82, N 12.24; found C 55.80, H 3.96, N 12.38。

(2) FeQ3的合成： 在反應瓶中加入HQ 41 mg(0.12 mmol)的乙醇(25 mL)溶液和FeCl3·6H2O 11 mg(0.04 mmol)的水(3 mL)溶液，攪拌下回流反應3 h。旋蒸除溶，殘余物用乙醇(3×3 mL)洗滌，真空干燥得紅褐色固體FeQ330 mg，產(chǎn)率70%； Anal.calcd for C48H36N9O12S3Fe: C 53.24, H 3.35, N 11.64; found C 53.01, H 3.57, N 11.32。

2 結(jié)果與討論

2．1 UV-Vis

Fe3+和Cys對HQ吸光性能的影響見圖1。由圖1可見，HQ的λmax=494 nm(lgε=3.95 M-1cm-1)，加入FeCl3后，出現(xiàn)了383 nm的新吸收峰，同時494 nm的吸收峰下降。采用Job plot法測得HQ和Fe3+形成3∶1型配合物。向HQ溶液中加入Cys后，UV-Vis吸收光譜幾乎沒有變化[圖1(a)和圖1(b)]，表明它們之間相互作用力很弱。相反，當同樣量的Cys加到HQ和Fe3+的混合溶液中后，383 nm吸收峰明顯下降，而494 nm的吸收峰顯著增強[圖1(c)和圖1(d)]。加入Hcy后，HQ的光譜變化情況與加入Cys相似。以上研究結(jié)果表明：HQ和Cys或Hcy之間的相互作用高度依賴加入的Fe3+。為了更好的響應Cys和Hcy，我們對所加入的Fe3+濃度做了優(yōu)化，結(jié)果表明：當Fe3+和HQ之比為1∶3時響應最靈敏。因此，下面的滴定實驗均是通過加入Cys或Hcy到FeQ3(20 μM)中性緩沖水溶液中進行的。

λ/nm

Cys或Hcy對FeQ3吸收光譜的影響見圖2。由圖2可見，加入Cys后，F(xiàn)eQ3溶液在383 nm的吸收峰逐漸下降，同時在494 nm形成紅移吸收峰，相應的溶液顏色由黃色變?yōu)榧t色。達到滴定終點時，該體系的吸收光譜和HQ非常相似，表明Cys和FeQ3發(fā)生了取代反應，釋放出HQ。加入Hcy后，F(xiàn)eQ3的吸收光譜和溶液顏色變化情況與加入Cys相似[圖2(B)]。比度法把兩個波長處吸光度的比值作為檢測信號能夠有效的減少環(huán)境的干擾，因此我們把494 nm和383 nm處的吸光度比值(A494/A383)對Cys或Hcy濃度做圖(圖2插圖)，從中可見隨Cys或Hcy的加入，A494/A383發(fā)生明顯的增強，當加入Cys或Hcy的量是FeQ3的量10倍時，達到滴定終點，A494/A383不再隨Cys或Hcy量的增加而改變。

λ/nm

λ/nm

2．2 FeQ3的選擇性識別

為了考察FeQ3作為Cys和Hcy探針的選擇性，分別將10倍量的不同氨基酸加入FeQ3(20 μM)溶液中，實驗結(jié)果顯示，除了Cys和Hcy,其余氨基酸的A494/A383比值沒有明顯的變化，表明FeQ3與這些氨基酸的結(jié)合能力較弱，不能發(fā)生取代反應;FeQ3只對Cys和Hcy有很好的識別選擇性。

對一個探針分子來說，存在可能的背景干擾組分時是否還能夠特異性的識別目標物是非常關(guān)鍵的，因此必須做干擾性實驗來檢測其抗干擾能力。當10倍量的其它天然氨基酸分別與FeQ3共存時，再向其中加入Cys或Hcy，與僅存在Cys或Hcy相比，檢測信號A494/A383沒有明顯的變化(圖3)。實驗事實進一步表明了FeQ3對Cys和Hcy具有良好的識別選擇性。

圖 3氨基酸對FeQ3的A494/A383的影響*

2.3 識別機理

根據(jù)2．2的實驗結(jié)果，推測可能的反應機理為：Cys把HQ從FeQ3中置換出來從而導致了吸收光譜的移動。為了驗證該反應機理，利用柱色譜法分離提純了FeQ3和Cys反應產(chǎn)物，其1H NMR譜圖與HQ的一致，證明在識別過程中發(fā)生了取代反應。

3 結(jié)論

基于取代反應原理，本文設計并合成了Fe3+配合物FeQ3。利用UV-Vis考察了FeQ3對天然氨基酸和高半胱氨酸的識別能力。研究結(jié)果表明：在中性緩沖水溶液中，Cys和Hcy能夠?qū)Q從FeQ3中置換出來，恢復HQ自由狀態(tài)，體系最大吸收峰由383 nm紅移至494 nm，溶液顏色由黃色變?yōu)榧t色，從而實現(xiàn)對Cys和Hcy的裸眼識別。通過競爭實驗表明其它的天然氨基酸不會對半胱氨酸和高半胱氨酸的識別產(chǎn)生干擾。FeQ3為具有潛在應用前景的Cys和Hcy光化學探針。

[1] Shahrokhian S.Lead phthalocyanine as a selective carrier for preparation of a cysteine-selective electrode[J].Anal Chem,2001,73(24):5972-5978.

[2] Wang W H, Rusin O, Xu X Y,etal.Detection of homocysteine and cysteine[J].J Am Chem Soc,2005,127(45):15949-15958.

[3] Lin W Y, Long L L, Yuan L,etal.A ratiometric fluorescent probe for cysteine and homocysteine displaying a large emission shift[J].Org Lett，2008,10(24):5577-5580.

[4] Zhang X J, Ren X S, Xu Q H,etal.One- and two-photon turn-on fluorescent probe for cysteine and homocysteine with large emission shift[J].Org Lett,2009,11(6):1257-1260.

[5] Zhang D Q.Highly selective colorimetric detection of cysteine and homocysteine in water through a direct displacement approach[J].Inorg Chem Commun,2009,12(12):1255-1258.

[6] Chen X Q, Zhou Y, Peng X J,etal.Fluorescent and colorimetric probes for detection of thiols[J].Chem Soc Rev,2010,39(6):2120-2135.

[7] Farruggia G, Lotti S, Prodi L,etal.8-Hydroxyquinoline derivatives as fluorescent sensors for magnesium in living cells[J].J Am Chem Soc,2006,128(1):344-350.

[8] Palacios M A, Wang Z, Montes V A,etal.Hydro xyquinolines with extended fluorophores:Arrays for turn-on and ratiometric sensing of cations[J].Chem Commun,2007,(36):3708-3710.

[9] Wang H, Wang W S, Zhang H S.Spectrofluorimetic determination of cysteine based on the fluorescence inhibition of Cd(Ⅱ)-8-hydroxyquinoline-5-sulphonic acid complex by cysteine[J].Talanta,2001,53(5):1015-1019.