白樹雄， 張洪剛， 葛 星， 王振營

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193）

自Losey等［1］在《自然》雜志上報道了轉(zhuǎn)基因玉米花粉能對帝王斑蝶造成傷害后，在全球范圍內(nèi)立即掀起了一場有關(guān)Bt玉米是否傷及帝王斑蝶的爭論，盡管最后證實該研究在試驗設(shè)計、方法上均存在問題［2］，但由此引發(fā)的Bt玉米對非靶標(biāo)昆蟲的影響的爭論至今從未停止。

轉(zhuǎn)基因抗蟲作物對天敵的影響主要有兩條途徑，一是天敵昆蟲直接取食轉(zhuǎn)基因抗蟲植物組織（如花粉、組織汁液等）或轉(zhuǎn)基因抗蟲植物上寄主體內(nèi)的Bt殺蟲蛋白所造成的直接毒性；二是轉(zhuǎn)基因抗蟲作物對寄主的影響（如營養(yǎng)質(zhì)量的改變）或寄主揮發(fā)性物質(zhì)發(fā)生了變化間接地影響到天敵的寄主搜尋、寄主識別和寄主接受行為以及生長發(fā)育等。許多捕食性和寄生性天敵可以取食植物的組織或產(chǎn)物，花粉、花蜜、蜜露和植物汁液都可以成為它們的食物。

亞洲玉米螟［Ostrinia f ur nacalis（Guenée）］屬世界性害蟲，也是我國玉米第一重要害蟲，嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量和質(zhì)量。腰帶長體繭蜂（Macrocentr us cingul u m Brischke）是亞洲玉米螟幼蟲的主要寄生性天敵，其自然寄生率可高達(dá)30%左右，對玉米螟種群起著重要的調(diào)控作用［3－4］。研究表明，飼喂玉米花粉液能顯著延長腰帶長體繭蜂的成蟲壽命［5］。

轉(zhuǎn)Bt基因作物的大面積種植，靶標(biāo)害蟲或非靶標(biāo)害蟲取食轉(zhuǎn)基因抗蟲植物組織后，殺蟲蛋白能否通過食物鏈向寄生性天敵傳遞？是否會對天敵昆蟲造成不良影響？同時，一些天敵昆蟲還可能直接取食轉(zhuǎn)基因作物的組織，直接攝取殺蟲蛋白，是否會對天敵昆蟲造成不良影響？本文主要研究腰帶長體繭蜂取食轉(zhuǎn)cr y1F基因玉米花粉后對其寄生率、壽命、繁殖力產(chǎn)生的影響，為進(jìn)一步明確轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米對非靶標(biāo)生物的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 供試?yán)ハx

腰帶長體繭蜂采自河北省保定市，在溫度26℃，相對濕度80%，光周期16L∥8D的條件下，置于養(yǎng)蜂籠（50 c m×40 c m×60 c m）中，飼以20%蜜糖水。

亞洲玉米螟幼蟲采用周大榮等標(biāo)準(zhǔn)養(yǎng)蟲技術(shù)和無瓊脂半人工飼料的飼養(yǎng)方法進(jìn)行飼養(yǎng)［6－7］。選用亞洲玉米螟4齡幼蟲供試。

1．2 供試玉米花粉

供試轉(zhuǎn)Bt基因玉米及其對照花粉均采自河北廊坊中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗基地。玉米品種為轉(zhuǎn)cry1F基因玉米及其對照品種。經(jīng)檢測，轉(zhuǎn)基因玉米花粉中Cr y1F蛋白含量為1 060 ng／g。

1．3 轉(zhuǎn)cry1F基因玉米花粉對腰帶長體繭蜂壽命的影響

在養(yǎng)蜂籠中分別放入水＋Bt玉米花粉、水＋對照玉米花粉、20%的蜂蜜水＋Bt玉米花粉、20%的蜂蜜水＋對照玉米花粉、20%的蜂蜜水和水的不同處理供成蜂取食，然后每籠引入腰帶長體繭蜂雌雄蜂各30頭。每日調(diào)查腰帶長體繭蜂的死亡狀況，直至所有繭蜂全部死亡為止。對各處理間腰帶長體繭蜂壽命進(jìn)行分析。

1．4 轉(zhuǎn)cry1F基因玉米花粉對腰帶長體繭蜂寄生及繁殖力的影響

將截為1 c m長的新鮮普通玉米稈若干放于直徑為20 cm培養(yǎng)皿中，然后接入50頭亞洲玉米螟4齡幼蟲，放入養(yǎng)蜂籠中，待其取食1 h后再引入腰帶長體繭蜂雌雄各10頭，寄生24 h。期間，養(yǎng)蜂籠中分別放入轉(zhuǎn)cr y1F基因玉米及對照玉米花粉、蜜水、水的不同處理供成蜂來取食。每日調(diào)查并更換亞洲玉米螟幼蟲供其寄生，試驗持續(xù)72 h。寄生后將玉米螟幼蟲接入瓊脂飼料中繼續(xù)飼養(yǎng)直到5齡末，挑出化蛹未寄生的玉米螟，計算寄生率、繭塊重量、每繭塊繭數(shù)及羽化率。

1．5 對取食轉(zhuǎn)cry1F基因玉米花粉后的腰帶長體繭蜂體內(nèi)Cry1F殺蟲蛋白的ELISA檢測

1．5．1 檢測方法

收集取食過不同處理轉(zhuǎn)基因玉米及對照玉米花粉的腰帶長體繭蜂單個個體稱量后放入滅菌研缽中，加入少許液氮研磨成粉狀，然后放入2 mL離心管中，加入Cry1F提取緩沖液1×PBST，4℃靜止30 min；低溫下（2～3℃）超聲波粉碎1 min，12 000 r／min離心10 min，取上清液，待測。Bt蛋白的定量測定按照試劑盒說明書方法進(jìn)行。

1．5．2 檢測儀器及試劑盒

酶標(biāo)儀（Multiskan Ascent，芬蘭 Ther mo公司）、臺式冷凍離心機(jī)（5804 R，德國Sig ma公司）、電子天平、移液器等；Bt－Cry1F ELISA 試劑盒（美國Agdia公司）。

1．6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

對不同處理的寄生率、繭塊重量、羽化率、壽命進(jìn)行方差分析（ANOVA LSD檢驗）（SAS Instit ute Inc．，1989）。

2 結(jié)果與分析

2．1 轉(zhuǎn)cry1F基因玉米花粉對腰帶長體繭蜂壽命的影響

對腰帶長體繭蜂壽命的試驗表明，取食水＋Bt玉米花粉的腰帶長體繭蜂的壽命與對照沒有顯著差異；取食蜂蜜水＋Bt玉米花粉的腰帶長體繭蜂雄蜂的壽命與對照相比差異達(dá)到顯著，但雌蜂的壽命與對照無顯著差異；差異還來自于蜂蜜水和水之間，取食含有蜂蜜水的玉米花粉，無論轉(zhuǎn)Bt基因花粉或?qū)φ栈ǚ燮鋲勖硷@著高于水＋玉米花粉處理（雌蜂：d f＝5，12，F(xiàn)＝23．48，p＜0．000 1；雄蜂：d f＝5，12，F(xiàn)＝54．80，p＜0．000 1）（表1）。

表1 不同食物對腰帶長體繭蜂壽命的影響

2．2 轉(zhuǎn)cr y1F基因玉米花粉對腰帶長體繭蜂寄生及繁殖力的影響

轉(zhuǎn)cr y1F基因玉米花粉對腰帶長體繭蜂的影響試驗表明，寄生時間為3 d內(nèi)各處理間腰帶長體繭蜂的寄生率（d f＝5，12；F＝0．88，p＝0．526 0）、繭塊重量（df＝5，12，F(xiàn)＝0．71，p＝0．618 0）、每繭塊繭數(shù)（df＝5，12，F(xiàn)＝0．60，p＝0．697 8）以及羽化率（df＝5，12，F(xiàn)＝1．46，p＝0．205 3）都沒有顯著差異（表2），說明取食含有轉(zhuǎn)cr y1F基因玉米花粉對腰帶長體繭蜂的寄生、生長發(fā)育和繁殖沒有顯著影響。

表2 不同食物對腰帶長體繭蜂寄生及繁殖力的影響

2．3 取食轉(zhuǎn)基因玉米花粉后的腰帶長體繭蜂ELISA檢測

飼喂前ELISA檢測表明，轉(zhuǎn)cr y1F基因玉米花粉中Cry1F蛋白含量為1 060 ng／g。

對取食轉(zhuǎn)cr y1F基因玉米花粉的腰帶長體繭蜂進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果表明，腰帶長體繭蜂取食含有轉(zhuǎn)cr y1F基因玉米花粉的食物1～7 d，在其體內(nèi)未檢測到轉(zhuǎn)基因成分（圖1）。

圖1 取食轉(zhuǎn)基因玉米花粉的腰帶長體繭蜂ELISA分析

3 結(jié)論與討論

隨著轉(zhuǎn)基因抗蟲作物種植范圍和面積的不斷擴(kuò)大，轉(zhuǎn)基因抗蟲作物對天敵昆蟲和其他非靶標(biāo)昆蟲的潛在影響受到關(guān)注［8－9］，特別是這些轉(zhuǎn)基因抗蟲作物已經(jīng)成為害蟲綜合治理的重要措施［10］。

捕食性和寄生性天敵昆蟲在捕食或寄生以轉(zhuǎn)基因抗蟲作物為食物的害蟲后，其存活、生長發(fā)育以及捕食或寄生能力的變化不盡相同，研究大多認(rèn)為殺蟲蛋白對天敵生長發(fā)育和種群動態(tài)無顯著影響［11］。用混有商業(yè)Bt制劑的蜂蜜瓊脂飼喂卷葉蛾赤眼蜂（Trichogramma cacoeciae），對雌蜂寄生能力沒有不利影響［12］。T．pr atissolii和短管赤眼蜂（T．pretiosum）在取食含有6種不同Bt制劑的蜂蜜溶液后，其壽命和繁殖力沒有受到不利影響［13］。擬澳洲赤眼蜂（T．confusum）雌蜂取食轉(zhuǎn)cry1Ac＋Cp TI基因棉花粉與對照相比，其壽命和寄生卵數(shù)無顯著影響［14］。Wang等［15］、吳研等［16］研究表明，轉(zhuǎn)cr y1Ab基因抗蟲玉米花粉對玉米螟赤眼蜂（T．ostriniae）的壽命、繁殖以及子代性比沒有不利影響。將轉(zhuǎn)cry1Ab基因的玉米花粉、純化的Cr y1 Ab蛋白分別拌入糖漿飼喂蜜蜂成蟲，結(jié)果表明取食花粉、Cr y1 Ab蛋白的蜜蜂存活率均無明顯差異［17］。表達(dá)Cr y1 Ab蛋白的Bt玉米花粉對意大利蜜蜂（Apis mellif era ligustica）的生長發(fā)育沒有不利影響［18－19］。利用表達(dá) Cry1 Ac殺蟲蛋白的Bt棉花粉和Cry1 Ab殺蟲蛋白的Bt玉米花粉處理桑葉飼喂不同 齡 期 的 家 蠶 （Bombyx nori）［20］和 利 用 轉(zhuǎn)cry1Ac和cry1A＋CpTI的棉花花粉處理柞樹葉飼喂柞蠶 （Antheraea pernyi）幼蟲后［21］，家蠶和柞蠶各齡期的死亡率、蛹重、繭重、化蛹率、羽化率和產(chǎn)卵量與對照沒有顯著差異。

本文研究結(jié)果表明，在腰帶長體繭蜂寄生亞洲玉米螟幼蟲時補充轉(zhuǎn)cr y1F基因玉米花粉作為食物對其寄生率、繭塊重量、每繭塊繭數(shù)、羽化率與對照玉米花粉無顯著差異；在蜂蜜水＋Bt基因玉米花粉處理中雖然與對照玉米花粉處理相比在雄蜂的壽命上有一定差異，但在雌蜂的壽命上并沒有顯著差異。雖然Bt玉米花粉中檢測到Cry1F殺蟲蛋白，但在取食Bt花粉的腰帶長體繭蜂中沒有檢測到Cry1F殺蟲蛋白。綜上，轉(zhuǎn)cry1F基因玉米花粉對腰帶長體繭蜂沒有不利影響，表達(dá)Cry1F殺蟲蛋白的Bt玉米作為害蟲綜合治理的重要措施與寄生性天敵腰帶長體繭蜂協(xié)同作用，可以有效減少抗性玉米螟的存活，延緩害蟲抗性的產(chǎn)生。

［1］ Losey J E，Rayor L S，Carter M E．Transgenic pollen har ms monarch larvae［J］．Nature，1999，399：214．

［2］ Hodgson J．Monarch Bt cor n paper questioned［J］．Nat ure Biotechnology，1999，17：627．

［3］ 劉德鈞．螟蟲長距繭蜂發(fā)生期的預(yù)測方法［J］．昆蟲天敵，1985，7（2）：95－99．

［4］ 馮建國，史更申，陶訓(xùn)，等．螟蟲長距繭蜂生物學(xué)及其利用的研究［J］．生物防治通報，1987，3（3）：102－105．

［5］ 呂仲賢，楊樟法，胡萃．玉米花粉對螟長距繭蜂成蟲壽命的影響［J］．華東昆蟲學(xué)報，1995，4（2）：61－64．

［6］ 周大榮，劇正理，劉寶蘭，等．玉米螟人工大量繁殖研究：I．一種半人工飼料及其改進(jìn)［J］．植物保護(hù)學(xué)報，1980，7（2）：113－122．

［7］ 宋彥英，周大榮，何康來．亞洲玉米螟無瓊脂半人工飼料的研究與應(yīng)用［J］．植物保護(hù)學(xué)報，1999，26（4）：324－328．

［8］ O’Callaghan M，Glare T R，Burgess E P J，et al．Effects of plant genetically modified for insect resistance on nontarget organism［J］．Annual Review of Ento mology，2005，50：271－292．

［9］ Romeis J，Meissle M，Bigler F．Transgenic crops expressing Bacill us thuringiensis toxin and biological control［J］．Nature Biotechnology，2006，24（1）：63－71．

［10］Sétamou M，Bernal J S，Legaspi J C，et al．Parasitism and location of sugarcane borer（Lepidoptera：Pyralidae）by Cotesia f l avipes（Hy menoptera：Braconidae）on transgenic and conventional sugarcane［J］．Environ mental Ent o mology，2002，31：1219－1225．

［11］張永軍，吳孔明，彭于發(fā)，等．轉(zhuǎn)基因植物的生態(tài)風(fēng)險［J］．生態(tài)學(xué)報，2002，22（11）：1951－1959．

［12］Hassan S A，Krieg A．Bacill us thuringiensis preparations har mless to t he parasite Trichogr a mma cacoeciae （Hy m．：Trichogra mmatidae）［J］．Zeit Pflanz Pflanz，1975，82：515－521．

［13］Polanczyk R A，Pratissoli D，Vianna U R，et al．Interaction bet ween natural enemies：Trichogramma and Bacill us thuringiensis in pest control［J］．Acta Sci Agron，2006，28：233－239．

［14］耿金虎，沈佐銳，李正西，等．常規(guī)棉花粉和轉(zhuǎn)Cr y1 Ac＋Cp－TI棉花粉對擬澳洲赤眼蜂繁殖和存活的影響［J］．生態(tài)學(xué)報，2005，25（7）：1575－1582．

［15］Wang Z Y，Wu Y，He K L，et al．Effects of transgenic Bt maize pollen on longevity and fecundity of Trichogr a mma ostriniae in laborator y conditions［J］．Bulletin of Insectology，2007，60（1）：49－55．

［16］吳研，王振營，何康來，等．轉(zhuǎn)Bt基因玉米Bt11花粉對玉米螟赤眼蜂繁殖和存活的影響［J］．昆蟲學(xué)報，2008，51（2）：227－233．

［17］Babendreier D，Kalberer N M，Ro meis J，et al．Influence of Bt－transgenic pollen，Bt－toxin and protease inhibitor （SBTI）ingestion on develop ment of t he hypopharyngeal glands in honeybees［J］．Apidologie，2005，36：585－594．

［18］田巖，張永軍，吳孔明，等．轉(zhuǎn)Bt－cr y1 Ac棉花花粉對意大利蜜蜂生長發(fā)育的影響［J］．應(yīng)用環(huán)境生態(tài)學(xué)報，2006，12（4）：464－467．

［19］田巖，張永軍，吳孔明，等．轉(zhuǎn)Bt－cr y1 Ab玉米花粉對意大利蜜蜂生長發(fā)育及體內(nèi)酶活性的影響［J］．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2006，16（4）：990－991．

［20］李文東，吳孔明，王小奇，等．轉(zhuǎn)cr y1 Ac和cr y1 A＋Cp TI基因棉花粉對柞蠶生長發(fā)育影響的評價［J］．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2003，11（5）：489－493．

［21］李文東，葉恭銀，吳孔明，等．轉(zhuǎn)抗蟲基因棉花和玉米花粉對家蠶生長發(fā)育影響的評價［J］．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35（11）：1543－1549．