郭 霞, 丁文姣, 楊甲月, 徐 蕊, 燕志強, 秦 波,2*

(1.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所/中國科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點實驗室/甘肅省天然藥物重點實驗室,蘭州 730000; 2.蘭州大學(xué)功能有機分子化學(xué)國家重點實驗室,蘭州 730000)

瑞香狼毒(Stellera chamaejasme Linn.)為瑞香科狼毒屬多年生草本植物,廣泛分布于我國東北、華北、西南及西北等地區(qū)的草地及高山向陽處,資源十分豐富[1-3]。瑞香狼毒有毒,為家畜所不食,且在北方草地大肆蔓延,致使優(yōu)良牧草逐年退化,造成草場逆行演替,使草地生態(tài)平衡遭受破壞,危害草地生態(tài)和畜牧業(yè)發(fā)展。因此,加強草原優(yōu)勢植物中活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究及合理利用,對于防止草原退化和毒草蔓延具有重要意義[4]。

馬鈴薯腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor T.)是一種常見的遷移性內(nèi)寄生線蟲,分布于歐、美、亞洲等地區(qū),已報道的寄主植物有120多種[5-6]。馬鈴薯腐爛莖線蟲對植物的危害不僅表現(xiàn)在掠奪寄主植物營養(yǎng)以及取食活動對植物根際造成損傷,更重要的是其食道腺分泌物會導(dǎo)致寄主植物發(fā)生一系列病理變化,以及刺激和促進其他病原物的繼發(fā)性侵染危害[7]。馬鈴薯腐爛莖線蟲是發(fā)生植物病害的一個重要誘因,可導(dǎo)致甘薯莖線蟲病[8]、當(dāng)歸麻口病[9]等多種病害的發(fā)生,影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。

有研究表明,瑞香狼毒根的乙醇提取物對菜粉蝶幼蟲、亞洲玉米螟幼蟲和桃蚜等多種害蟲有較強的生物活性[10],但對線蟲的觸殺活性尚未見有研究報道。本文以馬鈴薯腐爛莖線蟲為活性試驗?zāi)Ｐ?采用活體生物試驗方法,針對瑞香狼毒根提取物對馬鈴薯腐爛莖線蟲觸殺活性有效部位進行了研究,對瑞香狼毒豐富的植物資源的合理利用、植物源殺線蟲劑的研究和良性草地生態(tài)恢復(fù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物:瑞香狼毒(Stellera chamaejasme Linn.)植物根部,采自甘肅省岷縣高山草甸。

供試線蟲:馬鈴薯腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor Thorne),分離自河北省保定市甘薯田發(fā)生甘薯莖線蟲病的薯塊。

1.2 試驗方法

1.2.1 線蟲的分離

根據(jù)文獻報道[11],將采集到的受馬鈴薯腐爛莖線蟲危害的甘薯塊用自來水沖洗干凈,剖開病薯,切成薄片,用鑷子撕成小塊,采用貝曼漏斗分離法提取蟲體,待自然沉降后,用竹絲挑出,沖洗,收集。將分離得到的線蟲用無菌水洗出,沖入無菌指形管中,用0.5%的次氯酸鈉消毒2 min,用無菌水沖洗3遍,定容到一定體積放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 線蟲的培養(yǎng)

在PDA平板(約22 mL)中接入茄病鐮刀菌(Fusarium solani),于25℃溫箱中暗培養(yǎng)。待菌絲長滿整個培養(yǎng)皿后,在培養(yǎng)基中央刻一小口,加入消毒過的馬鈴薯腐爛莖線蟲約500條。將培養(yǎng)皿用封口膜(parafilm)包好,正置放入25℃溫箱中黑暗培養(yǎng),接種培養(yǎng)2～3 d后將培養(yǎng)皿皿蓋朝下放置,繼續(xù)培養(yǎng)35～40 d左右,取培養(yǎng)皿皿蓋上的線蟲供測定用。

1.2.3 瑞香狼毒根提取物的制備

對供試植物根干燥樣品進行粉碎,將瑞香狼毒根粗粉500 g置于底口瓶內(nèi),95%乙醇中浸泡過夜,以滲漉法提取,滲漉液減壓濃縮,得乙醇浸膏。乙醇浸膏以30%乙醇-水液混懸,分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯于室溫下連續(xù)萃取5次,合并萃取液,減壓濃縮,依次制得瑞香狼毒根的石油醚、氯仿、乙酸乙酯及水相萃取浸膏。于50℃下減壓干燥,分別制得乙醇提取物及不同極性部位萃取物,待試驗用。

1.2.4 觸殺活性測定

采用提取物的二甲基亞砜(DMSO)溶液與蟲樣液共混直接觸殺法進行試驗[7]。精確稱取瑞香狼毒根乙醇提取物及石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水相萃取物減壓干燥樣品,分別溶于DMSO中制成樣品母液。試驗時以適量DMSO釋成濃度為0.02 g/mL的試液進行觸殺活性測定。具體方法為:先將相同體積(V1)的線蟲懸浮液分別注入24孔細胞培養(yǎng)板的樣品孔內(nèi),再根據(jù)試驗濃度(N)需要,補充一定體積(V2)的無菌水,最后加入相應(yīng)量的藥劑母液(V3),混合均勻,置于溫度為25℃、濕度為80%～90%的培養(yǎng)箱中,每處理設(shè)3組重復(fù),每重復(fù)50～100條線蟲,分別以加入相應(yīng)濃度的DMSO和無菌水作為對照。處理后24、48、72 h分別記錄各處理組線蟲的死亡與存活情況。計算公式如下[12]:

每孔溶液的總體積(V)=線蟲懸浮液體積(V1)+

補充無菌水體積(V2)+藥劑母液體積(V3);

式中:每孔溶液的總體積(V)=線蟲懸浮液體積(V1)+補充無菌水體積(V2)+藥劑母液體積(V3),試驗濃度(N)事先設(shè)定,線蟲懸浮液體積(V1)固定不變(100μL),藥劑母液濃度(N0)已知,因此,在總體積(V)固定的情況下(400μL),就可以得出不同處理的無菌水體積(V2)及藥劑母液體積(V3)[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和DPS 3.1軟件對試驗數(shù)據(jù)進行整理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 狼毒提取物對馬鈴薯腐爛莖線蟲室內(nèi)觸殺活性測定結(jié)果

瑞香狼毒根提取物及不同極性萃取物對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性試驗結(jié)果見表1、圖1。

由表1和圖 1可以看出,處理后24、48、72 h,狼毒根乙醇提取物對馬鈴薯腐爛莖線蟲均表現(xiàn)出明顯的觸殺活性,并且石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水相萃取物在不同濃度下對馬鈴薯腐爛莖線蟲表現(xiàn)出的觸殺活性也不同。藥劑處理后24 h,乙醇提取物、氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物處理的線蟲校正死亡率均達到了60%以上,三者之間無顯著差異。其中,乙酸乙酯萃取物對馬鈴薯腐爛莖線蟲的活性最強,校正死亡率達69.49%,與石油醚萃取物之間有顯著差異(p＜0.05),與水相萃取物之間存在極顯著性差異(p＜0.01)。藥劑處理48 h后,各處理組的線蟲死亡率繼續(xù)增加,乙醇提取物、氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物處理的線蟲校正死亡率達到了70%以上,均與水相萃取物之間存在極顯著差異(p＜0.01)。其中,乙酸乙酯萃取物對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺率達80.58%。藥劑處理72 h后,乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物處理的線蟲校正死亡率達到了80%以上。其中,乙酸乙酯萃取物處理的線蟲校正死亡率達86.88%,其與石油醚萃取物和水相萃取物之間均存在極顯著差異(p＜0.01)。由此可以看出,乙酸乙酯萃取物對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性最強,其次為氯仿萃取物、石油醚萃取物、水相萃取物(圖1)。

表1 瑞香狼毒不同根提取物及不同溶劑萃取物對馬鈴薯腐爛莖線蟲室內(nèi)觸殺活性測定

圖1 不同時間瑞香狼毒根提取物對馬鈴薯腐爛莖線蟲的室內(nèi)活性比較

2.2 瑞香狼毒根提取物對馬鈴薯腐爛莖線蟲的毒力比較與線性分析

為了進一步對供試乙醇提取物和各溶劑萃取物進行活性篩選和比較,對各提取物進行了系統(tǒng)毒力測定。根據(jù)預(yù)試驗,將供試各提取物用 DMSO溶解,配制成濃度為0.1 g/mL的樣品母液,試驗時再將母液稀釋為 1%、2%、3%、5%、7%、10%、15%、20%8個試驗濃度,對馬鈴薯腐爛莖線蟲的毒力測定結(jié)果如表2所示。

瑞香狼毒根提取物與不同溶劑萃取物對馬鈴薯腐爛莖線蟲觸殺毒性作用的線性分析結(jié)果見表2,處理后不同時間,由瑞香狼毒根乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物的回歸方程可以看出,乙酸乙酯萃取物的作用強度基本與乙醇總提取物的作用趨勢一致,兩者的毒力分析都具有良好的量效關(guān)系,并且不同萃取物對馬鈴薯腐爛莖線蟲的毒力與其觸殺活性呈現(xiàn)出一致的趨勢,LC50由小到大順序依次為:乙酸乙酯萃取物＜氯仿萃取物＜石油醚萃取物＜水萃取物。由此可見,乙酸乙酯萃取物是瑞香狼毒線蟲觸殺活性的有效成分,隨著提取物中活性化學(xué)成分含量的增加,對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性增強。

表2 瑞香狼毒根的不同提取物對馬鈴薯腐爛莖線蟲的毒力測定

3 討論

我國地跨溫、熱兩帶,植物種類繁多,作物復(fù)種指數(shù)高,沙暖性土壤比例大,適于線蟲繁殖危害,線蟲病對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的損失高于世界平均水平,且危害日趨嚴(yán)重[13]。長期以來,植物線蟲病的防治主要依賴化學(xué)防治,目前所用殺線蟲劑多屬高毒農(nóng)藥[14],在環(huán)境保護及農(nóng)產(chǎn)品殘毒等方面的壓力下,這些藥劑將逐漸遭禁止。植物源殺線蟲劑由于其性能優(yōu)異,不易使線蟲產(chǎn)生抗藥性,以及良好的環(huán)境相容性,引起了世界范圍內(nèi)許多國家的重視。從自然界植物中尋找環(huán)境友好天然殺線蟲活性物質(zhì)的研究,已成為化學(xué)和生物學(xué)研究領(lǐng)域的一大熱點[15]。

據(jù)記載,狼毒有良好的殺蟲效能,我國民間就有將其細粉用于植物病蟲害防治的實踐經(jīng)驗,將瑞香狼毒根曬干研成細粉,翻地時放入溝內(nèi),可殺死地下害蟲[16]。本文以對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害嚴(yán)重的馬鈴薯腐爛莖線蟲作為室內(nèi)活性試驗?zāi)Ｐ?測試并比較了瑞香狼毒根乙醇提取物及石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水萃取物對馬鈴薯腐爛莖線蟲的室內(nèi)觸殺活性,并且進行了毒力比較。首次報道了瑞香狼毒根乙醇提取物對馬鈴薯腐爛莖線蟲有較強觸殺活性,乙酸乙酯萃取部位的作用強度基本與乙醇總提取物的作用趨勢一致,而且兩者的毒力分析都具有良好的量效關(guān)系,由此可見,乙酸乙酯萃取部位是瑞香狼毒線蟲觸殺活性的有效部位,隨著提取物中活性化學(xué)成分含量的增加,對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性增強,為線蟲觸殺活性化學(xué)物質(zhì)研究以及植物源殺線蟲劑的研究奠定了基礎(chǔ),同時也為瑞香狼毒的資源利用和草地生態(tài)建設(shè)提供了依據(jù)。

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