袁 蕊， 敖宗華， 丁海龍， 徐 勇， 付 勛， 沈才洪， 黃治國

(1．四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢 643000;2．瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000)

高粱黃酮的提取及其測定方法的建立

袁 蕊1， 敖宗華2， 丁海龍2， 徐 勇2， 付 勛1， 沈才洪2， 黃治國1

(1．四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢 643000;2．瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000)

選用乙醇作為提取溶劑，對高粱中總黃酮進(jìn)行提取，研究乙醇濃度、浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比對高粱黃酮提取率的影響．并通過單因素及正交試驗(yàn)，確定了高粱黃酮的最佳提取工藝:乙醇濃度為65%，80℃下浸提2 h，料液比為6∶100．此工藝下提取的高粱黃酮含量為0.54%．

高粱;黃酮;測定

高粱，又稱蜀黍，其產(chǎn)品用途廣泛，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，既可食用、飼用，又可用于加工．高粱是生產(chǎn)白酒的主要原料，在釀酒過程中有著不可替代的作用．高粱籽粒中除含有碳水化合物、脂類、蛋白質(zhì)、單寧、香氣成分以及多種有機(jī)酸外，還含有黃酮類化合物．黃酮類化合物具有抗氧化、降血糖、降壓、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等作用［1］．在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域人們利用黃酮研發(fā)出抗心血管藥物、止咳平喘藥等，臨床上用來治療冠心病、心絞痛、高血壓等疾?。?－3］．研究表明在適宜溫度下，發(fā)酵中總黃酮含量呈上升趨勢［4］，而高粱作為釀酒的原料，隨著發(fā)酵周期的延長，經(jīng)過微生物作用，發(fā)酵過程中生成的酒精濃度也越高，而黃酮類化合物易溶于乙醇，在白酒蒸餾過程中即被帶入到酒體中．因此，高粱作為酒體中黃酮類化合物的主要來源，研究其黃酮的提取與測定具有重要意義．

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

高粱粉，國窖紅1號高粱，實(shí)驗(yàn)室制取;蘆丁，中國藥品生物制品檢定所;95%乙醇，鎂粉，成都市科龍化工試劑廠;濃鹽酸，四川西隴化工有限公司．以上試劑均為分析純．

1.2 試驗(yàn)儀器設(shè)備

高速中藥粉碎機(jī)，浙江省永康市溪岸五金藥具廠;電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器廠;UV－1600紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司;電子天平，梅特勒－托利多儀器有限公司．

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

高粱樣品除雜后，粉碎過40目篩，備用．

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液

準(zhǔn)確稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用95%乙醇溶解，并定容到100 mL得質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液．

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.5，2.5，5.0，7.5，10，12.5，15 mL分別置于50 mL容量瓶中，加95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，以95%乙醇為空白對照，于359 nm［5］處測定吸光度，以吸光度值(A)對濃度(c)作圖，建立回歸方程:c=A×X+b．

1.3.4 樣品的定性及含量的測定

吸取黃酮粗提液5 mL，加入到50 mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，于359 nm處測定吸光度．鹽酸－鎂粉反應(yīng)和氨水反應(yīng)進(jìn)行定性分析［6］，確定提取液中黃酮類化合物的含量．

1.3.5 單因素試驗(yàn)

稱取一定量的高粱樣品于250 mL錐形瓶中，加入100 mL一定濃度的乙醇溶液，浸提相應(yīng)時(shí)間，提取高粱中黃酮類物質(zhì)．分別分析乙醇濃度、浸提溫度、浸提時(shí)間以及料液比對提取黃酮類化合物的影響程度．

1.3.6 正交試驗(yàn)

各因素之間存在著相互影響，為了確定最佳的提取工藝條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、浸提溫度、提取時(shí)間、料液比為分析因素，以測得的高粱黃酮類物質(zhì)提取量為分析指標(biāo)，選用L9(34)正交表對高粱黃酮類化合物的提取工藝進(jìn)行研究，見表1．

表1 正交試驗(yàn)L9(34)因素水平表Tab．1 Factor and levels of orthogonal test L9(34)

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以吸光度值(A)對濃度(c)作圖，建立回歸方程:c=68.026×A－0.610 1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1．

圖1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．1 Flavonoids standard curve

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對提取黃酮的影響

采用不同濃度的乙醇對高粱粉進(jìn)行浸提，實(shí)驗(yàn)條件為:水浴溫度70℃，料液比3∶100，浸提2 h，溶劑(V/V)為55%，65%，75%，85%，95%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2．可以看出隨著乙醇濃度的提高，吸光度呈上升的趨勢，75%時(shí)達(dá)到最大值;乙醇濃度再增高，黃酮類物質(zhì)減少，這可能是由于一些醇溶性雜質(zhì)、色素等成分溶出量增加，導(dǎo)致黃酮類的溶解度降低，提取量下降［7］．

圖2 乙醇濃度對黃酮提取的影響Fig．2 Effect of different concentrations of alcohol on extraction of flavonoids

2.2.2 浸提溫度對提取黃酮的影響

采用不同水浴溫度對高粱粉進(jìn)行浸提，實(shí)驗(yàn)條件為:75%乙醇溶液，料液比3∶100，浸提2 h，水浴溫度為50，60，70，80，90 ℃，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3．從圖3中可以看出溫度在60～70℃時(shí)，溫度升高黃酮提取量逐漸增大，這是由于溫度升高，分子的運(yùn)動加劇，滲透、擴(kuò)散、溶解速度加快［8］，黃酮物質(zhì)轉(zhuǎn)移到溶劑的幾率更大．當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，黃酮物質(zhì)可能被氧化破壞，導(dǎo)致其含量有所下降，而且溫度越高，乙醇揮發(fā)程度也越嚴(yán)重，浸提過程需不斷補(bǔ)加溶劑，不利于節(jié)約成本．

圖3 不同浸提溫度對黃酮提取的影響Fig．3 Effect of different temperature on extraction of flavonoids

2.2.3 浸提時(shí)間對黃酮提取的影響

采用不同浸提時(shí)間對高粱粉進(jìn)行浸提，實(shí)驗(yàn)條件為:75%乙醇溶液，70℃水浴，料液比3∶100，浸提0.5，1，1.5，2，2.5 h．實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 4．由圖 4 可知在0.5～1.5 h時(shí)，黃酮提取量逐漸增大，1.5 h時(shí)達(dá)到最大，時(shí)間過短，黃酮類物質(zhì)未完全溶出，當(dāng)時(shí)間延長，由于過長時(shí)間的加熱會使部分黃酮類物質(zhì)氧化破壞，雜質(zhì)的溶出也對產(chǎn)量有影響，在1.5～2 h濃度稍有下降，在2～3 h黃酮類物質(zhì)的濃度趨于平衡．

圖4 不同浸提時(shí)間對黃酮提取的影響Fig．4 Effect of different time on extraction offlavonoids

2.2.4 料液比對黃酮提取的影響

采用不同料液比進(jìn)行浸提，實(shí)驗(yàn)條件:75%乙醇溶液，70 ℃水浴溫度，浸提 2 h，料液比為 1∶100，2∶100，3∶100，4∶100，5∶100，6∶100，7∶100，8∶100，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5．由圖5可知當(dāng)料液比增加到6∶100時(shí)，再增加料液比吸光度趨于穩(wěn)定．

圖5 不同料液比對黃酮提取的影響Fig．5 Effect of different material－ liquid ratio on extraction of flavonoids

2.3 高粱黃酮提取最佳工藝確定

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以高粱黃酮含量為考察指標(biāo)，對4個(gè)因素采用正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝，見表2．A因素為溶劑濃度，B因素為浸提時(shí)間，C因素為浸提溫度，D因素為料液比，由表2中的極差R來看，正交試驗(yàn)所考查的4個(gè)因素對黃酮提取效果的影響程度從大到小依次為A＞C＞D＞B，乙醇濃度對高粱黃酮提取率的影響最大，其最優(yōu)組合為A1B3C3D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，80℃下浸提2 h，料液比為 6∶100．

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab．2 Results of orthogonal test

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

在確定的最佳提取工藝下，將濾渣按最佳提取條件做二次提取，然后在選定波長下測定吸光度，結(jié)果無吸收，證明本法已將黃酮提取完全．

2.5 回收率試驗(yàn)

精確移取2.5 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和5 mL最佳工藝下提取的黃酮提取液5 mL于50 mL容量瓶中，共5份，用95%乙醇溶液定容，搖勻，測吸光度，計(jì)算回收率，得平均回收率為99.57%，結(jié)果見表3．

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab．3 Results of recovery test

3 結(jié)論

通過定性分析證明高粱粗提液中含有黃酮類物質(zhì)．通過正交試驗(yàn)確定了高粱黃酮的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，80℃下浸提2小時(shí)，料液比為6∶100．此工藝不僅提取黃酮完全，重現(xiàn)性良好，而且具有較高回收率，在此工藝下測得國窖紅1號高粱黃酮含量為0.54%．

［1］宋小凱．天然藥物化學(xué)［M］．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004:72－113．

［2］郭長江．食物類黃酮物質(zhì)有營養(yǎng)學(xué)意義［J］．中國食物與營養(yǎng)，2004(5):38－42．

［3］林琳．仙人掌的天然活性成分研究回顧［J］．廣西植物，2002，22(4):375－381．

［4］靳桂敏，林朝朋，鐘瑞敏．崗稔黃酮苷在果酒發(fā)酵過程中穩(wěn)定性研究［J］．食品科技，2006(5):91－94．

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［6］劉金榮，趙文斌，王航宇．超聲提取快速鑒定黃酮類化合物［J］．華西藥學(xué)雜志，2002，17(2):141－143．

［7］范媛媛，李新華，劉蘭英．綠豆黃酮提取工藝研究［J］．沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，36(5):619 －622．

［8］劉北林，董繼生，霍紅．山楂黃酮最佳提取工藝探討［J］．食品科學(xué)，2007，28(6):167－170．

(責(zé)任編輯:檀彩蓮)

Extraction and Quantitative Determination of Flavonoids in Sorghum

YUAN Rui1， AO Zong-hua2， DING Hai-long2， XU Yong2， FU Xun1，SHEN Cai-hong2，HUANG Zhi-guo1
(1．College of Bioengineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，China;2．Luzhou Laojiao Co．Ltd．，Luzhou 646000，China)

Extraction of flavonoids in sorghum using ethanol was studied．The effects of ethanol concentration，temperature，extraction time，and ratio of material to solvent were studied．The optimum conditions of extraction were obtained as follows:65%ethanol，solid/liquid ratio of 6∶100，extraction time of 120 min under 80℃ under the optimal conditions，the content of total flavonoids was 0.54%．

sorghum;flavonoids;determination

TS261

A

1671-1513(2011)04-0042-04

2011－04－26

瀘州老窖科研獎(jiǎng)學(xué)金項(xiàng)目“有機(jī)原糧收儲工藝研究”(09ljzk16)．

袁 蕊，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程;

敖宗華，男，高級工程師，博士，主要從事發(fā)酵工程方面的研究．通訊作者．