李 濤, 胡曉青, 姜科聲, 周春燕

(1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華 321004;2.北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,北京 100191)

GATA4是調(diào)控心臟基因表達的重要轉(zhuǎn)錄因子,參與了心臟的正常發(fā)育、起搏節(jié)律形成、功能基因表達和心肌肥大等生理、病理過程.

小鼠 GATA4的 mRNA早在交配后 7.0～7.5 d便可在胚胎心臟中胚層檢測到,并可持續(xù)表達,其蛋白質(zhì)在心臟中胚層和原始心管的表達比心臟特異性收縮蛋白要早 6～12 h[1-2].GATA4缺失的小鼠在胚胎發(fā)育第 8～9天因心臟發(fā)育畸形和前腸腹側(cè)閉合缺陷而導(dǎo)致死亡,胚胎腹側(cè)不能融合而出現(xiàn)心管分叉,形成雙心管[3-4].GATA4在成年鼠中調(diào)控多種心臟結(jié)構(gòu)基因,如α-肌球蛋白重鏈 (α-MHC)、心鈉素 (ANF)、腦鈉素 (BNP)等[2].GATA4是導(dǎo)致心肌肥大的一個關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因子[5].機械刺激或體液刺激可通過MAPK和ERK1/2通路激活 GATA4,GATA4與激活蛋白-1(AP-1)和活化 T細胞核因子 (NFAT)首先誘導(dǎo)c-fos和 c-jun表達,繼之使胚胎期基因α-MHC,ANF和 BN P表達增加,以及收縮蛋白基因如α-actin及內(nèi)皮素 (ET-1)等基因表達上調(diào),蛋白合成增加,細胞體積增大[5-7].此外,GATA4亦是重要的心肌抗凋亡分子,在阿霉素、柔毛霉素和氯化汞誘導(dǎo)凋亡時,GATA4被MAPK/ERK通路磷酸化,親核能力和轉(zhuǎn)錄活性增強,降解減慢,能夠誘導(dǎo) Bcl-xL表達,發(fā)揮抗凋亡作用[8-12].在 B cl-2基因轉(zhuǎn)錄起始位點前 266 bp處含有一個保守的GATA位點,GATA4能夠激活 B cl-2表達,通過RNAi抑制乳鼠心肌細胞中 GATA4的表達,則Bcl-2的表達降低 48%[13].

關(guān)于 GATA4的功能研究正在逐步深入,但由于原代心肌細胞轉(zhuǎn)染效率低,難以進行常規(guī)轉(zhuǎn)基因操作,需要借助于病毒感染等方法實現(xiàn)GATA4在心肌細胞的過表達.本研究構(gòu)建了 GATA4過表達的重組腺病毒,包裝病毒感染原代心肌細胞,從而為深入研究 GATA4的功能、挖掘 GATA4的下游靶基因提供了有力的轉(zhuǎn)基因工具.

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

含 GATA4 cDNA全長序列的 pCG-GATA4質(zhì)粒由加拿大蒙特利爾大學(xué) NemerM教授惠贈.腺病毒穿梭質(zhì)粒 pAdTrackcmv,骨架質(zhì)粒pAdEasy-1,JM109菌和BJ5183菌均為北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化系保存.

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建及 Ad-GATA4腺病毒包裝鑒定

使用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒,此系統(tǒng)由去除了 E1和 E3區(qū)的缺陷性腺病毒AdEasy-1和穿梭質(zhì)粒 pAdTrackcmv組成.pCGGATA4質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶 XbaⅠ酶切,回收GATA4基因片段,pUC18載體連接.經(jīng) B amH Ⅰ和NotⅠ酶雙切鑒定插入方向后,將正向插入GATA4基因的 pUC18-GATA4載體行 BamH Ⅰ和SalⅠ雙酶切,釋放目的片段,與經(jīng) B glⅡ和 SalⅠ酶切線性化的 pAdTrack連接,轉(zhuǎn)化挑選克隆后經(jīng)XbaⅠ酶切鑒定.正確插入目的片段的pAdTrackcmv-GATA4穿梭質(zhì)粒用 Pm eⅠ進行線性化并經(jīng)凝膠回收,再轉(zhuǎn)入到攜帶腺病毒骨架載體 pAdEasy-1的 E.coli.BJ5183菌株進行細菌內(nèi)重組.利用卡那霉素抗性和 PacⅠ酶切鑒定,獲得重組正確的 pAd-GATA4腺病毒質(zhì)粒.提取質(zhì)粒DNA后,PacⅠ酶切線性化,按照 lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)入 293A細胞中進行病毒包裝.分別于感染后 2,4,7,14 d在熒光顯微鏡下連續(xù)觀察病毒噬斑的變化;14 d后收集細胞,液氮反復(fù)凍融細胞 4次,1 000 r/min離心 10 min后收集上清液.利用收集的病毒重復(fù)感染 293A細胞擴增病毒.倍比稀釋后感染 293A細胞,24 h后熒光顯微鏡觀察,按發(fā)熒光細胞數(shù) ×稀釋度 /病毒液體積計算病毒滴度.對照病毒為北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化系既往構(gòu)建.

1.3 Western blot檢測 GATA4表達

重組 Ad-GATA4腺病毒的鑒定:HeLa細胞接種于 24孔板上,培養(yǎng)過夜后分別加入 100感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MO I)的病毒液,48 h后棄培養(yǎng)液,提取蛋白,BCA(Bicinchoninic acid)法蛋白定量.30μg蛋白樣本中加入 2×上樣緩沖液,煮沸后,12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE),電轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉1 h后加入抗 GATA4或抗 GAPDH抗體 (體積比1∶1 000)進行雜交,辣根過氧化物酶 (HRP)標記的二抗以1∶2 000稀釋,用化學(xué)發(fā)光法進行顯色.同樣的方法對乳鼠心肌細胞病毒感染后進行檢測.蛋白條帶經(jīng)灰度掃描后由Multi Gauge軟件(v3.0)進行半定量分析.

1.4 乳鼠心肌細胞離體培養(yǎng)及感染

出生 1～3 d的大鼠,無菌操作下取出心臟,剪除心房,將心室放于含 0.1%胰蛋白酶和0.05% Ⅰ型膠原酶的消化液中,剪碎后置于 4℃冰箱消化 1 h,離心,加入含 5%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基制成細胞懸液,以差速貼壁法取心肌細胞,將細胞密度調(diào)至 5×105～6×105細胞 /mL,接種于 12孔板中,37℃,5%CO2,繼續(xù)培養(yǎng)至 24 h后見細胞搏動.

待細胞穩(wěn)定生長 24～48 h后,感染不同MO I的腺病毒,24 h后熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光表達效率和細胞形態(tài)變化,選擇最適感染劑量.Hoechst 33342復(fù)染 1 h顯示細胞核的形態(tài),Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡下隨機選取 5個視野拍照,隨機選擇 5～10個細胞測量發(fā)光心肌細胞的表面積.

1.5 實時定量聚合酶鏈反應(yīng) (Real-time PCR)

按照 Trizol試劑說明書提取細胞的總 RNA,取 4μg經(jīng) AMV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA作為PCR的模板.將 4μg總 RNA與 2μL隨機引物溶液 (0.5μg/μL)混合,加焦碳酸二乙酯 (DEPC)處理水補足至終體積為12.5μL,70℃水浴變性5 min,置冰上 5 min.每管中再加入下列試劑:4μL反應(yīng)緩沖液,2μL三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)溶液 (10 mmol/L),0.5μL核糖核酸酶抑制劑 (RNasin)溶液 (40 U/μL),1μL AMV溶液(200 U/μL),加 DEPC處理水補足至 20μL后混勻,輕微離心,37℃反應(yīng) 1 h,70℃滅活 5 min,離心 1 min,-80℃保存?zhèn)溆?采用 TOYOBO公司的SYBR Green Real-time PCR MasterMix在AB I7700型定量 PCR儀上進行 PCR反應(yīng).反應(yīng)體系如下:7.5μL 2×SYBR Green Master Mix buffer試劑,0.25μL正向引物溶液 (10 pmol/μL),0.25μL反向引物溶液 (10 pmol/μL),1μL cDNA模板溶液,滅菌去離子水補足至 15μL.PCR反應(yīng)條件:95℃變性 10 min,95℃15 s,60℃ 1 min,40循環(huán).測定樣品的循環(huán)閾值 (Cycle threshold,Ct),通過計算 2-ΔΔCt比較不同樣品之間特定基因的表達AN F基 因 正 向 引 物 為 5′-ATCTGATGGATTTCAAGAACC-3′,反 向 引 物 為 5′-CTCTGAGACGGGTTGACTTC-3′;GAPDH基因正向引物為 5′-GCACCACCAACTGCTTAGC-3′,反向引物為5′-TCTTCTGGGTGGCAGTGATG-3′.

1.6 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)以 x ±s表示,采用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行 t檢驗和單因素方差分析.

2 結(jié) 果

2.1 重組 GATA4腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

pCG-GATA4質(zhì)粒經(jīng) XbaⅠ單酶切后釋放2.6 kb的 GATA4表達片段,在紫外燈下切下該片段,與 XbaⅠ單酶切的 pUC18載體連接.由于GATA4編碼基因于 350 bp左右處含一內(nèi)源 N otⅠ酶切位點,因此由 B amH Ⅰ和 N otⅠ雙酶切判別GATA4基因在 pUC18載體中的插入方向,正向插入的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切將釋放一約 350 bp的片段,反向插入將釋放一約 2.2 kb的片段.因此,經(jīng)鑒定 4號克隆為正向克隆 (見圖 1(a)).將克隆方向正確的 pUC18-GATA4質(zhì)粒經(jīng) B amHⅠ和SalⅠ雙酶切釋放 GATA4基因片段;同時,將pAdTrackcmv骨架質(zhì)粒使用 B glⅡ和 SalⅠ雙酶切,使其線性化,同樣在紫外燈下切下該片段.上述DNA片段均經(jīng)凝膠回收、連接、轉(zhuǎn)化至 JM109感受態(tài)細菌中,過夜培養(yǎng)挑選克隆,繼續(xù)培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)化菌,小量提取質(zhì)粒 DNA.

為了鑒定 GATA4片段是否插入 pAdTrackcmv骨架質(zhì)粒中,需要進行酶切鑒定.由于 pAdTrackcmv-GATA4質(zhì)粒中 BglⅡ位點已遭破壞,故使用GATA4片段內(nèi)部酶切位點 XbaⅠ進行鑒定.質(zhì)粒經(jīng) XbaⅠ酶切后鑒定結(jié)果如圖 1(b)所示,可知:克隆 2,3,4均為正確插入 GATA4片段的克隆.

pAdTrackcmv-GATA4經(jīng) Pm eⅠ線性化,轉(zhuǎn)入事先轉(zhuǎn)入腺病毒骨架質(zhì)粒 pAdEasy-1的 BJ5183菌進行同源重組,經(jīng)卡那霉素篩選,重組克隆經(jīng)PacⅠ酶切鑒定.正確重組的質(zhì)?？汕谐?3.0或4.5 kb的片段.酶切結(jié)果見圖 1(c),陽性克隆切 出 4.5 kb的片段,pAd-GATA4質(zhì)粒構(gòu)建成功.

圖 1 pAd-GATA4質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

2.2 重組 GATA4腺病毒的包裝

將經(jīng)過 PacⅠ線性化的 pAd-GATA4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 293A細胞進行包裝.轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察病毒噬斑:2 d起逐步出現(xiàn)噬斑;14 d后有大量的病毒噬斑形成 (見圖 2),293A大量表達增強型綠色熒光蛋白 (EGFP),形態(tài)變圓并且呈漂浮狀態(tài).此時收獲細胞裂解后繼續(xù)感染 293A細胞,擴增病毒,倍比稀釋法測定病毒滴度,重組Ad-GATA4滴度為 6×1011efu/mL.

圖 2 原代病毒包裝

2.3 GATA4重組腺病毒的鑒定

為了進一步對 Ad-GATA4腺病毒進行鑒定,將 Ad-GATA4腺病毒感染無內(nèi)源性 GATA4表達的 HeLa細胞,并通過蛋白質(zhì)印跡法 (Western blot)檢測發(fā)現(xiàn) GATA4的表達 (見圖 3),而未感染病毒的 HeLa細胞及感染對照病毒的細胞均未檢測到 GATA4表達.

圖 3 Western blot法檢測 GATA4蛋白表達

2.4 GATA4重組腺病毒感染乳鼠心肌細胞

胰酶消化和差速貼壁法分離乳鼠心肌細胞,細胞形態(tài)呈短桿分支狀,有自發(fā)搏動.原代乳鼠心肌細胞生長 24～48 h,狀態(tài)穩(wěn)定后按MO I為 100的病毒量感染乳鼠心肌細胞,激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn) 80%以上的細胞表達 EGFP,發(fā)光細胞形態(tài)清晰,表明感染成功,且結(jié)果顯示 Ad-GATA4誘導(dǎo)心肌細胞表面積明顯增加,肌纖維更加豐富(見圖 4).隨機挑選視野測定細胞表面積,對照病毒感染的心肌細胞表面積為 (360±104)μm2,感染 GATA4病毒的心肌細胞表面積為 (489±124)μm2(見圖 5(a)).提取蛋白檢測發(fā)現(xiàn),Ad-GATA4感染后心肌細胞 GATA4蛋白表達上升 2.3倍(P<0.01.見圖 5(b)).提取 RNA進行實時定量PCR檢測 GATA4下游基因 ANF表達,以 GAPDH作為內(nèi)參,結(jié)果顯示 Ad-GATA4組 ANF表達明顯增強,比 Ad-Con組高 6倍 (P<0.01.見圖 5(c)).這些結(jié)果表明 Ad-GATA4腺病毒成功感染大鼠心肌并誘導(dǎo)了其心肌肥大表型的出現(xiàn).

圖 4 Ad-GATA4感染乳鼠心肌細胞激光共聚焦顯微鏡觀察圖

圖 5 乳鼠心肌細胞肥大指標的檢測

3 討 論

由于常規(guī)方法如磷酸鈣、脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染原代心肌細胞效率低下,逆轉(zhuǎn)錄病毒又無法感染非增殖細胞,而攜帶外源基因的腺病毒或慢病毒則可高效感染非增殖細胞,因而成為研究心肌細胞病理生理變化的有效轉(zhuǎn)基因工具.本實驗成功地包裝重組 GATA4腺病毒,感染原代乳鼠心肌細胞,并結(jié)合 EGFP的表達,可方便有效地檢測到細胞呈現(xiàn)肥大表型,細胞表面積增大,心肌胚胎期基因ANF表達增高.

重組 GATA4病毒可應(yīng)用于多個研究領(lǐng)域,如干細胞向心肌細胞的誘導(dǎo)分化、抗缺血凋亡及心肌梗死后心肌重構(gòu)與修復(fù)、心肌肥大機制研究等.

既往研究認為 GATA4是心肌細胞分化發(fā)育的關(guān)鍵基因,GATA4基因缺失可致胚胎死亡,而不同位點的錯義突變導(dǎo)致心臟發(fā)育畸形,與臨床先天性心臟病的發(fā)生密切相關(guān).在干細胞誘導(dǎo)分化領(lǐng)域的研究表明,GATA4過表達可促進 P19畸胎瘤干細胞及胚胎干細胞向自發(fā)搏動的心肌細胞定向分化[14].骨髓間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)心肌微環(huán)境的誘導(dǎo)下能夠分化為心肌細胞,心肌梗死區(qū)局部注射能有效改善心功能指標.過表達 GATA4誘導(dǎo)臍帶血干細胞及誘導(dǎo)多能干細胞 (iPS cells)向心肌的特異定向分化正在研究之中.如果通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入 GATA4因子或其他心肌關(guān)鍵因子,將可能增加干細胞誘導(dǎo)分化效率[15-17].

心肌細胞凋亡可見于各種心臟疾病,如缺血性心肌梗死、高糖性心肌重構(gòu)、蒽環(huán)類抗癌劑致心肌毒性.GATA4具有較強的抗凋亡作用,可能與其上調(diào)抗凋亡基因 Bcl-2和 B cl-xL有關(guān).此外,GATA4亦具有抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及調(diào)節(jié)自噬的作用[18-19].文獻 [20]構(gòu)建了 GATA4與穿膜蛋白VP22的融合蛋白表達載體,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染心肌成纖維細胞,然后注射到左室冠脈前降支結(jié)扎模型大鼠的心肌梗死區(qū),移植 6周后,發(fā)現(xiàn)能夠縮小梗死區(qū)面積,誘導(dǎo)周邊區(qū)代償性肥大,減輕病理性重構(gòu),恢復(fù)心功能.本研究構(gòu)建的重組 GATA4病毒是否有助于改善心肌梗死后的心功能,有待進一步實驗研究.

GATA4是一個重要的心肌肥大相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子.心肌肥厚是心肌細胞體積增大而不是心肌細胞增殖,盡管最初的心肌肥厚能夠增加損傷心肌的心排出量,但是長期心肌肥厚最終會導(dǎo)致心臟功能喪失代償而發(fā)生心排出量降低,失代償后發(fā)

生心力衰竭,并可發(fā)生擴張性心肌病、心肌梗死、心律失常和猝死.因此,確定心臟肥大的分子機制非常重要,將有助于找到預(yù)防和治療的有效措施.實驗證明 GATA4的過度表達能誘導(dǎo)心肌肥厚,但機制尚不完全清晰.本研究所構(gòu)建的重組 GATA4腺病毒提供了良好的轉(zhuǎn)基因工具,將有助于心肌肥大分子機制的研究,挖掘 GATA4下游靶基因.

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