孫曉霞，趙占民，劉道亮，張峻峰

(河北出入境檢驗(yàn)檢疫局，河北石家莊，050051)

應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)快速定量檢測(cè)UHT奶產(chǎn)品中的微生物*

孫曉霞，趙占民，劉道亮，張峻峰

(河北出入境檢驗(yàn)檢疫局，河北石家莊，050051)

采 用基于單個(gè)活細(xì)胞的新型熒光標(biāo)記技術(shù)，精確區(qū)分UHT奶樣品中的活菌細(xì)胞與死細(xì)胞以及其他大顆粒物質(zhì)，并應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)對(duì)UHT奶產(chǎn)品進(jìn)行微生物快速定量檢測(cè)。通過(guò)與傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)檢測(cè)方法進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，F(xiàn)CM方法的檢測(cè)范圍為101～107CFU/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于平板計(jì)數(shù)法。2種方法的計(jì)數(shù)結(jié)果相關(guān)性分析表明，在一定菌液濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)CM方法的定量結(jié)果與平板計(jì)數(shù)法線性相關(guān)良好，且對(duì)不同類型菌種都能精確標(biāo)記定量，是更為快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

流 式細(xì)胞術(shù)，UHT奶，微生物，定量檢測(cè)

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)是20世紀(jì)70年代起源于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的一門新興技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)診斷和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域［1－2］，但是在食品安全監(jiān)測(cè)方面尚在起步階段。

流式細(xì)胞術(shù)的熒光染劑一般分為膜滲透性、膜非滲透性和膜電位敏感性等3種，對(duì)活菌和死菌、大顆粒物質(zhì)難以進(jìn)行標(biāo)記區(qū)分［3］。本實(shí)驗(yàn)采用新型標(biāo)記技術(shù)，以市售UHT奶為實(shí)驗(yàn)材料，模擬產(chǎn)品在生產(chǎn)、流通環(huán)節(jié)中受到微生物污染的情況下，利用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行快速檢驗(yàn)，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與傳統(tǒng)平板檢驗(yàn)方法進(jìn)行了比對(duì)。同時(shí)在檢測(cè)產(chǎn)品中人為添加了細(xì)菌、酵母菌以及霉菌的模式或代表菌株，證明通過(guò)采用流式細(xì)胞術(shù)的2個(gè)核心技術(shù):熒光標(biāo)記及流式細(xì)胞儀檢測(cè)平臺(tái)［4］，能夠?qū)z測(cè)材料中的活菌進(jìn)行精確定量。

1 材料與方法

1.1 UHT奶產(chǎn)品

為了對(duì)比不同品牌的UHT奶成分是否會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，研究中選購(gòu)了當(dāng)?shù)厥忻嫔陷^常見(jiàn)、銷量較大的6種品牌產(chǎn)品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 本研究中所用UHT奶產(chǎn)品

1.2 試驗(yàn)菌株

研究中所采用的大腸桿菌為細(xì)菌的模式菌株，同時(shí)也是食品受到污染后最常存在的腸道致病菌，它與金黃色葡萄球菌分別代表了常見(jiàn)食品致病菌中的革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽(yáng)性菌?？莶菅挎邨U菌代表了乳產(chǎn)品中常見(jiàn)的芽孢桿菌。釀酒酵母作為酵母菌的模式菌株，也是食品中廣泛存在的。黑曲霉是存在于環(huán)境和食品原料中的常見(jiàn)霉菌代表菌株。具體見(jiàn)表2所示。

表2 本研究中所用菌株

1.3 儀器設(shè)備

流式細(xì)胞分析儀(BactiFlow ALS系統(tǒng)，法國(guó)AES)，離心機(jī)(Sigma3K15，德國(guó)Sigma)，生化培養(yǎng)箱(LRH-150B，中國(guó)廣東)，渦旋混合器(MS1，德國(guó)IKA)，超純水儀(KL-UP-UN-10，中國(guó)臺(tái)灣艾柯)。濁度計(jì)(ZDY-Ⅱ，上海復(fù)星佰珞)。

1.4 培養(yǎng)基和試劑

FCM基礎(chǔ)試劑:

(1)ChemSol S 50X(code:300-R3106-01)，鞘液，用于分析過(guò)程中清洗或做保護(hù)液。

(2)Dilunt R(code:400-R6008-01)和CSR(code:300-R4095-01)，用于減少游離熒光。

(3)Isored(code:300-R3709-01)，隔離空氣中的氧氣。

(4)Cleaning5(code:300-R3107-02)清洗液，在分析過(guò)程中清洗進(jìn)樣口。

(5)Cleaning3(code:300-R3064-01)清洗液，用于每天試驗(yàn)結(jié)束后清洗系統(tǒng)。

FCM檢測(cè)試劑:

(1)Standard G(code:300-R5095-01)，細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)液(標(biāo)準(zhǔn)熒光珠子)，日?？刂圃噭?。

(2)Standard A(code:300-R5068-01)，霉菌與酵母菌標(biāo)準(zhǔn)液(標(biāo)準(zhǔn)熒光珠子)，日常控制試劑。

(3)ChemSol B26/1(code:400-R2702-02)，標(biāo)記緩沖液。

(4)ChemChrome V26(code:400-R1006-01)，細(xì)菌標(biāo)記底物。

(5)CS26 A(code:400-R4105-01)，標(biāo)記細(xì)菌時(shí)減少背景熒光(含內(nèi)標(biāo)物)。

CS26 B(code:400-R4106-01)，用于優(yōu)化標(biāo)記過(guò)程。在使用前和CS26 A混合，混合液僅限于當(dāng)天使用。

(6)CSV(code:400-R4102-01)，標(biāo)記霉菌與酵母菌時(shí)減少背景熒光，含內(nèi)標(biāo)物。

(7)CS13(code:400-R4108-01)減少非特異性標(biāo)記。

(8)ChemChrome V8(code:400-R1002-01)，霉菌與酵母菌標(biāo)記底物。

以上試劑均購(gòu)自法國(guó)的AES公司。

培養(yǎng)基:營(yíng)養(yǎng)肉湯，平板計(jì)數(shù)瓊脂，孟加拉紅培養(yǎng)基，PDA液體培養(yǎng)基。均購(gòu)自北京陸橋公司。

1.5 熒光標(biāo)記

常用的FCM熒光染料通常存在著不能進(jìn)入完整細(xì)胞膜或不能區(qū)分標(biāo)記活細(xì)胞和死細(xì)胞，消除背景干擾等問(wèn)題。本研究中采用ChemChrome V26熒光標(biāo)底物標(biāo)記細(xì)菌，ChemChrome V8熒光標(biāo)記底物標(biāo)記霉菌和酵母菌。樣品分裝到試管中上機(jī)后，儀器自動(dòng)抽取并分裝底物進(jìn)行標(biāo)記。底物中均含有非熒光的二聚體底物，只有具膜完整性的活菌細(xì)胞中才存在的酯酶才能將非熒光二聚體底物中的酯鍵切斷，形成單聚體與活細(xì)胞結(jié)合而發(fā)出綠色熒光，這樣就避免了樣品內(nèi)死菌細(xì)胞和其它大顆粒物質(zhì)的干擾。標(biāo)記后的樣品懸液被包裹在鞘液中經(jīng)過(guò)噴嘴高速噴出，形成一條狹窄的分析流，確保細(xì)胞逐個(gè)通過(guò)激光聚焦的測(cè)量區(qū)，進(jìn)而由光敏元件測(cè)量每個(gè)細(xì)胞或顆粒產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度，從而獲得各種信號(hào)參數(shù)，并由數(shù)字處理器進(jìn)行分析，對(duì)樣品中的活菌進(jìn)行精確定量［5］。整個(gè)標(biāo)記過(guò)程由儀器自動(dòng)完成。

1.6 試驗(yàn)方法

1.6.1 不同產(chǎn)品的熒光背景檢測(cè)

為了確定不同產(chǎn)品成分組成是否在用FCM方法檢測(cè)時(shí)會(huì)產(chǎn)生不同的熒光背景，并消除其對(duì)本研究中定量結(jié)果的干擾，首先對(duì)不同樣品進(jìn)行熒光背景檢測(cè)。在無(wú)菌條件下打開(kāi)產(chǎn)品包裝，用滅菌移液管吸取10 mL樣品于無(wú)菌試管中，每種樣品取4個(gè)平行，做好熒光標(biāo)記后立即放入樣品槽中，開(kāi)始程序，儀器會(huì)以機(jī)械手臂操控進(jìn)樣探頭，自動(dòng)依次從各待測(cè)試管中吸取1 mL樣品上機(jī)檢測(cè)。

1.6.2 自然增菌快速檢測(cè)

為了模擬UHT奶產(chǎn)品在生產(chǎn)、流通、貨架等真實(shí)環(huán)境中受到微生物污染的情況，本研究中將所購(gòu)奶產(chǎn)品在無(wú)菌條件下開(kāi)封取樣，先利用FCM進(jìn)行快速檢測(cè)，同時(shí)以傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法作為對(duì)照，以確定樣品是無(wú)菌的。將樣品在無(wú)菌環(huán)境中打開(kāi)包裝，然后暴露于自然空氣中放置24 h。這時(shí)樣品已受到環(huán)境中微生物污染并大量繁殖。為了保證檢測(cè)的模擬真實(shí)性，以增菌后的樣品為母液，以未開(kāi)封的同類無(wú)菌樣品為稀釋液進(jìn)行10倍數(shù)的梯度稀釋，共做8個(gè)梯度，并立即上機(jī)檢測(cè)。同時(shí)每個(gè)梯度各取1 mL于無(wú)菌平皿中，傾注高壓滅菌后冷卻到45℃的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，混勻凝固后于37℃下培養(yǎng)48h計(jì)數(shù)，各做3個(gè)平行［6］。

1.6.3 人為添加標(biāo)準(zhǔn)菌株的確證試驗(yàn)

將表2中所列菌種分別活化并在各自適宜的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接培養(yǎng)2代后，挑取細(xì)菌單菌落接種于滅菌后的10 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯管中于37℃培養(yǎng)24 h，制成菌懸液，經(jīng)濁度計(jì)測(cè)定菌液濃度為1×109～5×109CFU/mL;挑取霉菌和酵母菌接種于滅菌后的PDA液體培養(yǎng)基中于25℃培養(yǎng)48h，制成菌懸液，經(jīng)濁度計(jì)測(cè)定菌液濃度分別約為3×108CFU/mL和6×107CFU/mL。以無(wú)菌操作，各取1 mL上述菌懸液，分別添加到9 mL無(wú)菌的UHT奶樣品中，振蕩混勻作為待檢樣品，并依次做10倍比梯度稀釋，共做8個(gè)梯度，將其放置于流式細(xì)胞分析儀樣品槽內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，同時(shí)用滅菌移液器吸取每稀釋度樣品于無(wú)菌平皿中，分別傾注計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(細(xì)菌)和孟加拉紅培養(yǎng)基(酵母菌和霉菌)作計(jì)數(shù)培養(yǎng)，各做3個(gè)平行［7］。

1.6.4 結(jié)果分析

將FCM方法的檢測(cè)結(jié)果與平板計(jì)數(shù)方法結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，并進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 背景測(cè)定

研究中采用的6種品牌的UHT奶樣品無(wú)菌開(kāi)封后經(jīng)FCM法檢測(cè)結(jié)果如下所示。

表3 FCM法測(cè)定不同品牌樣品背景

從表3可以看出，各品牌樣品的檢測(cè)值均小于1 CFU/mL，證明通過(guò)新方法標(biāo)記，均未產(chǎn)生太大的熒光背景，即本方法可以很好地排除樣品中大顆粒物質(zhì)的干擾。各樣品的平均值方差為0.035 42，小于0.05，即各樣品檢測(cè)結(jié)果之間差異不顯著，可以選擇一種產(chǎn)品繼續(xù)后面的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。本研究中選擇了伊利UHT奶作為后面的實(shí)驗(yàn)材料。

2.2 自然增菌檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。從2種檢驗(yàn)方法的定量結(jié)果中可以看出，在樣品菌液濃度從104～107CFU/mL，應(yīng)用FCM方法可以對(duì)樣品進(jìn)行精確定量，且各重復(fù)之間重現(xiàn)性很好;而平板計(jì)數(shù)法則因?yàn)槌隽擞?jì)數(shù)范圍而無(wú)法定量。在樣品菌液濃度從101～103CFU/mL，2種檢測(cè)方法均可以進(jìn)行定量檢測(cè)，且各自重復(fù)之間的重現(xiàn)性很好。說(shuō)明FCM方法采用激光讀取熒光值，數(shù)字處理系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)數(shù)，不受人工讀數(shù)能力的限制，在檢測(cè)限上大大優(yōu)越于傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法;且不受樣品背景干擾，可以將未處理的成品樣本直接上機(jī)檢測(cè)，大大簡(jiǎn)化了微生物檢驗(yàn)步驟。

表4 自然增菌檢測(cè)

圖1 自然增菌實(shí)驗(yàn)FCM計(jì)數(shù)法與平板計(jì)數(shù)法相關(guān)性分析

以FCM檢測(cè)方法與平板計(jì)數(shù)方法的定量結(jié)果平均值為對(duì)象進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖1所示。2種檢測(cè)方法的定量結(jié)果呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，說(shuō)明兩者結(jié)果高度符合?；貧w斜率為0.961 3，說(shuō)明FCM方法的定量結(jié)果要略高于平板計(jì)數(shù)結(jié)果。該現(xiàn)象的原因是因?yàn)槠桨逵?jì)數(shù)方法要依靠人工讀數(shù)，可能會(huì)因人為因素而影響結(jié)果，而流式細(xì)胞儀的自動(dòng)檢測(cè)平臺(tái)計(jì)數(shù)精確度要高于人工讀數(shù)。并且樣品中的受損微生物細(xì)胞可能會(huì)因?yàn)榛謴?fù)較慢而不能在限定的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)形成單一菌落，從而影響計(jì)數(shù)結(jié)果;而基于熒光標(biāo)記計(jì)數(shù)的FCM檢測(cè)方法則不存在這個(gè)問(wèn)題［8－9］。

2.3 人為添加標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在本部分實(shí)驗(yàn)中，樣品中添加的各種標(biāo)準(zhǔn)菌株用FCM法均能精確計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)范圍從101到107CFU/mL，且梯度性很好(見(jiàn)表5)。而平板計(jì)數(shù)法的計(jì)數(shù)范圍只能從101到103CFU/mL。說(shuō)明在本研究中采用的FCM檢測(cè)方法可以對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、芽孢桿菌、酵母菌和霉菌都進(jìn)行熒光標(biāo)記和準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。將每種菌株的兩種檢測(cè)方法都在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)的計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖2所示。

檢測(cè)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的兩種方法結(jié)果相關(guān)系數(shù)均為1，說(shuō)明2種方法檢測(cè)細(xì)菌的計(jì)數(shù)結(jié)果高度相關(guān)。釀酒酵母和黑曲霉菌2種方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，說(shuō)明2種方法對(duì)酵母菌和真菌的檢測(cè)結(jié)果也高度相關(guān)。從而驗(yàn)證了FCM法對(duì)UHT奶樣品中各種微生物進(jìn)行 定量檢測(cè)的結(jié)果準(zhǔn)確性［10－11］。

表5 人為增菌計(jì)數(shù)結(jié)果

圖2 人為添加標(biāo)準(zhǔn)菌株實(shí)驗(yàn)2種定量方法結(jié)果的相關(guān)性分析

3 結(jié)論

在食品衛(wèi)生監(jiān)管過(guò)程中，檢驗(yàn)人員在幾分鐘或幾個(gè)小時(shí)內(nèi)向產(chǎn)品管理者提供微生物的分析結(jié)果，能夠?qū)ιa(chǎn)、運(yùn)輸和庫(kù)存環(huán)節(jié)的微生物污染進(jìn)行及時(shí)有效的控制而產(chǎn)生巨大效益，同時(shí)也大大降低了食品安全事故的發(fā)生率。目前，微生物檢測(cè)方法根據(jù)生物發(fā)光原理已經(jīng)發(fā)展到能在幾分鐘得到結(jié)果［12］，但由于分析所需敏感性的限制并不能提供計(jì)數(shù)，因此應(yīng)用于衛(wèi)生監(jiān)測(cè)存在著局限性。

本研究采用非熒光底物對(duì)單個(gè)可見(jiàn)活細(xì)胞進(jìn)行特殊標(biāo)記，每個(gè)細(xì)胞將被流式細(xì)胞儀系統(tǒng)的超敏感信號(hào)放大器檢測(cè)和計(jì)數(shù)。在這個(gè)系統(tǒng)中，熒光信號(hào)將被實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并通過(guò)尖端軟件進(jìn)行分析以區(qū)分被標(biāo)記的活細(xì)胞和其它非微生物的大顆粒物質(zhì)以及死細(xì)胞。利用FCM進(jìn)行樣品分析是完全自動(dòng)化的，每小時(shí)能提供40～50個(gè)處理結(jié)果，效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)［13］。而且省去了前處理和后繼培養(yǎng)步驟，比傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)周期縮短了24～120 h［14］。并且通過(guò)與平板計(jì)數(shù)法的比對(duì)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了FCM檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。

FCM檢測(cè)技術(shù)具有2大特點(diǎn):計(jì)數(shù)和分選。本試驗(yàn)中僅是對(duì)FCM技術(shù)應(yīng)用于UHT奶產(chǎn)品的微生物安全定量監(jiān)測(cè)方面進(jìn)行了初步研究。在進(jìn)一步研究中可利用FCM分選技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)同一樣品里的不同微生物或細(xì)胞進(jìn)行定性和分選提取。該技術(shù)在食品安全監(jiān)管方面有著廣大的應(yīng)用前景。

［1］ 楊懷德，張才軍，李秀義，等.流式細(xì)胞術(shù)在微生物學(xué)中的應(yīng)用［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2006，12(13):825－827.

［2］ 李慶，馬筱玲，李柏青.流式細(xì)胞術(shù)在臨床細(xì)菌學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，2002 ，23(6):344－345.

［3］ Patkar A，Vijayasankaran N，Urry D W，et al.Flow cytometry as a useful tool for process development:rapid evaluation of expression systems［J］.J Biotechnol，2002 ，93(3):217－229.

［4］ 張藝.流式細(xì)胞儀構(gòu)成與工作原理［J］.醫(yī)療設(shè)備信息，2005，20(8):25－26.

［5］ Lionnel L，Jean-Louis D.Sterility test in UHT milk［J］.Aes Chemunex，2006，10:1－9.

［6］ GB 4789.2－2010［S］.食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定.

［7］ GB 4789.15－2010［S］.食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù).

［8］ 謝小梅，許楊.流式細(xì)胞術(shù)［J］.中國(guó)生物工程雜志，2003，23(9):100－104.

［9］ Jones D L，Brailsford M A，Drocourt J L.Solid-phase，laser-scanning cytometry:a new two-hour method for the enumeration of microorganosms in pharmaceutical water［J］.Pharmacopeial Forum，1999，25(1):7 626 －7 645.

［10］ 肖安風(fēng)，周祥山，周利，等.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)畢赤酵母的細(xì)胞活性［J］.微生物學(xué)通報(bào)2006，33(6):22－26.

［11］ 張波，陳君，盧啟威，等.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)啤酒酵母在含油酸培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的定量研究［J］.現(xiàn)代儀器，2008(2):17－20.

［12］ John P Nolan，Loretta Yang.The flow of cytometry into systems biology［J］.Briefings in Functional Genomics and Proteomics，2007，6(2):81－90.

［13］ Kacmar J，Zamamiri A，Carlson R，et al.Single-cell variability in growing Saccharomyces cerevisiae cell populations measured with automated flow cytometry［J］.Biotechnol，2004，109(3):253 －268.

［14］ Van Poucke S O，Nells H J.A 210-min solid phase cytometry test for the enumeration of Escherichia coli in drinking water［J］.Journal of Applied Microbiology，2000，89:390－396.

［15］ Thusitha S Gunasekera，Paul V Attfield，Duncan A V，et al.A flow cytometry method for rapid detection and enumeration of total bacteria in milk［J］.Applied and Environmental Micorbiology，2005，66(3):1 228 －12 321.

［16］ Winson M K，Davey H M.Flow cytometric analysis of microorganisms［J］.Methods，2000，21:231 －240.

Quantitatively Detect Microorganism in UHT Milk Rapidly by Using Flow Cytometry

Sun Xiao-xia，Zhao Zhan-min，Liu Dao-liang，Zhang Jun-feng
(Hebei Entry-Exit Inspection and Quanrantine Bureau，Shijiazhuang 050051，China)

In this research we distinguish the live cells，dead cells and other large particles accurately in the UHT milk samples using a new Fluorescence Labeling Technique basing on single live cell，and quickly detect microorganism quantitatively by using flow cytometry.Comparison with traditional plate counting method shows that the detection range of FCM is 101～107CFU/mL，far above that of plate counting method.Correlation analysis of the results of the two methods shows that within certain concentration range of bacteria solution，the results of FCM and plate counting method are linear，and FCM is a more accurate and rapid detection method for different types of microorganism.

flow cytometry，UHT milk，microorganism，quantitatively detect

碩士，工程師。

*國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2009IK174)

2010－04－16，改回日期:2010－12－10