王春霞，路福平，劉逸寒，杜連祥，李明潤

1(工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津，300457)2(天津市醫(yī)藥科學研究所，天津，300020)

納膜過濾在提取紅棗環(huán)磷酸腺苷(cAMP)中的應(yīng)用*

王春霞1，路福平1，劉逸寒1，杜連祥1，李明潤2

1(工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津，300457)2(天津市醫(yī)藥科學研究所，天津，300020)

紅 棗經(jīng)過浸泡、打漿、酶解、壓濾、樹脂吸附、甲酸洗脫后，采用150 nm納濾膜在壓差為0.5～1 MPa下過濾，結(jié)果表明:納濾截留組分經(jīng)過紫外掃描在波長258 nm處峰值與環(huán)磷酸腺苷(cAMP)標準品相同，而納濾液組分(棄去液)在波長258 nm處無峰;又經(jīng)過HPLC檢測納濾截留組分與環(huán)磷酸腺苷(cAMP)標準品出峰時間相同，而納濾液組分(棄去液)在此時間處無峰。表明納濾截留目標產(chǎn)物環(huán)磷酸腺苷(cAMP)效果明顯，分離了大分子組分及小分子組分，納濾后利于濃縮、純化得到環(huán)磷酸腺苷(cAMP)成品。

納 膜過濾，截留組分，紅棗，環(huán)磷酸腺苷，濃縮

納膜過濾(nanofiltration，簡稱“納濾”NF)技術(shù)是介于傳統(tǒng)分離范圍的超濾和反滲透之間的一種新型分子級膜分離技術(shù)。納濾膜截留的相對分子質(zhì)量約為200～1 000，可以同時進行脫鹽和濃縮并具有相當快的處理速度［1－4］。本文采用經(jīng)過納膜過濾分離工藝處理后的紅棗汁中大分子組分及小分子組分，被截留組分即為目標產(chǎn)物環(huán)磷酸腺苷(cAMP)及部分其他組分，使之達到濃縮的目的。再經(jīng)結(jié)晶、純化后為環(huán)磷酸腺苷(cAMP)純品。

棗屬藥食同源植物。紅棗中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量為100～600 nmol/g(3.29～19.74 mg/100 g)，在180多種天然植物中，紅棗中的含量最高［5－6］;環(huán)磷酸腺苷(cAMP)由腺嘌呤、核糖和磷酸組成，其分子中磷酸基與核糖的3’和5’位2個羥基構(gòu)成兩個酯鍵的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量為329.21;環(huán)磷酸腺苷(cAMP)作為某些激素的第二信使激活心肌細胞內(nèi)依賴cAMP的蛋白激酶，使底物蛋白磷酸化，對于治療心血管疾病具有不可替代的作用，cAMP具有多種生理功能和藥理作用［5］，因此探索分離和純化的手段、降低能耗，最大限度地提取紅棗中的有效成分cAMP并實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)具有很大的實用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

紅棗:挑選無霉變、無蟲害的天津產(chǎn)地紅棗。

環(huán)磷酸腺苷(cAMP)標準品:德國BM公司。

205×7強堿性陰離子交換樹脂(80～100目):南開大學化工廠。硅膠板GF254:青島海洋化工廠分廠(規(guī)格:50 mm×100 mm)。

1.2 設(shè)備

小型膜分離設(shè)備(S500)，不銹鋼管式膜(20/150 nm)，上海凱能高科技工程有限公司;10L不銹鋼浸提灌(DC-TQ-10)，上海達程實驗設(shè)備有限公司;小型立式打漿機(TL130)，保定前進食品機械有限公司;10L板式過濾機(DO-2)，天津市東麗區(qū)通達濾材器廠;高效液相色譜儀(Agilent 1100)，美國Agilent公司;色譜柱 TC-C18，(4.6 mm ×250 mm，10 μm)，美國安捷倫科技公司;紫外光譜UV-260，SHIMADZU(島津)，日本;紫外掃描儀(722E)，上海第三分析儀器廠;10 L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-5210A)，上海亞榮生化儀器廠;離心噴霧干燥設(shè)備(ZPG-25)常州市爾諾干燥設(shè)備有限公司;玻璃層析柱(12 cm×120 cm)等。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點

(1)紅棗清洗，將其室溫浸泡(果水質(zhì)量比=1∶4～6)12 h、蒸煮、打漿，達到漿核分離，取漿液。

(2)漿液轉(zhuǎn)入浸提罐，加入果膠酶50～60℃、2～3 h酶解、板框過濾機壓濾得到紅棗汁，棗渣另用。

(3)將紅棗汁轉(zhuǎn)入攪拌罐中與活化后的陰離子樹脂混合攪拌4～6 h，進行特異性吸附、結(jié)合，過濾后得到吸附了棗汁中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的樹脂，用約樹脂2～4倍體積量的水攪拌清洗樹脂，洗去絮狀物等雜質(zhì);

(4)將吸附后的樹脂層析柱上樣，用0.5 mol/L甲酸溶液洗脫，控制流速1.8～2.2 mL/min，此時被吸附在樹脂上的目標產(chǎn)物隨著甲酸洗脫液析出;并用紫外掃描儀隨時檢測，當洗脫液的波峰在256～258 nm處時，吸收峰﹤0.3時表明目標產(chǎn)物隨著甲酸洗脫液從樹脂上析出，可結(jié)束洗脫。

(5)甲酸洗脫液經(jīng)納膜過濾，控制流速30～35l/h，其壓差為0.5～1 MPa，截留組分中為相對分子質(zhì)量200～1 000含有目標產(chǎn)物環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的濃縮液，濾出組分為大分子及水和甲酸等小分子組分，此為第一步濃縮。再回收納濾后的甲酸重復使用。

(6)納濾后截留的含有目標產(chǎn)物環(huán)磷酸腺苷(cAMP)等組分的濃縮液，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進行第二步濃縮，濃縮至原甲酸洗脫液體積的1/10停止。濃縮液進行離心噴霧干燥，得到含量30%的cAMP粉末狀粗品，可用于食品添加劑;再經(jīng)過乙醇結(jié)晶、純化后得到環(huán)磷酸腺苷(cAMP)成品，可用于醫(yī)藥原料。

1.3.3 檢測方法

1.3.3.1 紫外掃描儀測定法(UV)［7］

由1.3.2(4)層析后的甲酸洗脫液或取樣品3 mL在波長200～400 nm掃描，檢測到樣品在256～258 nm處與環(huán)磷酸腺苷(cAMP)標準品相似的峰。該方法應(yīng)用于紅棗cAMP提取過程中做定性分析的檢測、樹脂交換力測定以及測定樣品cAMP含量。

1.3.3.2 薄層色譜法(TLC)［8］

GF254硅膠板點樣，展開劑為V(苯)∶V(乙酸乙酯)∶ V(甲醇)=1∶1∶3，紫外燈254 nm檢測。該方法應(yīng)用于紅棗cAMP提取后產(chǎn)品性能的定性檢測。

1.3.3.3 高效液相色譜法(HPLC)［9－10］

色譜柱:TC-C18;流動相0.02 mol/L KH2PO4-甲醇(體積比80∶20);檢測波長:258nm。

標準品溶液的制備:精密稱取cAMP標準品10 mg，置于10 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，作為儲備液。使用時稀釋成100 μg/mL溶液。

樣品:自紅棗中提取，進樣量20 μL，流速為1.0 mL/min。

工作曲線:準確稱量并配制 cAMP 12、36、60、84、108 μg/mL濃度溶液，制作工作曲線，得回歸方程:Y=1.692 65e－5x+0;r=0.999 6，結(jié)果可見工作曲線的線性關(guān)系良好。

該方法應(yīng)用于測定紅棗cAMP在12～108 μg/mL內(nèi)，呈非常好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。其他各項內(nèi)容均符合要求，證明此方法穩(wěn)定、可靠、準確、快速，可用于紅棗提取cAMP含量的測定和成品cAMP純度測定。

1.3.3.4 回收甲酸含量測定方法

紅棗cAMP分離過程中，為了觀察0.5 mol/L甲酸洗脫液經(jīng)納膜過濾后棄去的甲酸能否再利用，建立甲酸含量測定方法。

酸堿滴定法:取10 mL的0.5 mol/L甲酸對照品和待測定的回收甲酸溶液，分別加入帶磨口塞的三角瓶中，各加2滴酚酞指示劑，用0.5 mol/L標準氫氧化鈉溶液滴定至淡粉色，比較0.5 mol/L甲酸對照組和待測定的回收組滴定消耗NaOH mL數(shù)的差別，并作統(tǒng)計學處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅棗(天津產(chǎn)地)cAMP含量測定

根據(jù)1.3.3.3所述的測定方法和紅棗cAMP含量樣品制備方法，測定原料紅棗cAMP的含量，結(jié)果如表1。

表1 紅棗cAMP含量測定結(jié)果

由表1可知原料紅棗cAMP含量為10.88 mg/100 g，該值與文獻報道［5］接近。

2.2 洗脫時間與目標產(chǎn)物環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量的關(guān)系

2.2.1 甲酸洗脫初始的目標產(chǎn)物環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量

將1.3.2(3)經(jīng)0.5 mol/L甲酸洗脫，收集從樹脂柱洗脫下來的流出液做紫外掃描檢測，以觀察紅棗提取液中cAMP與樹脂交換情況(如圖2所示)。圖1為cAMP標準品在波長200～400 nm紫外掃描圖譜，圖2為甲酸洗脫初始(約1 h)在波長200～400 nm紫外掃描圖譜。

圖1 cAMP標準品紫外掃描圖譜

圖2 甲酸初洗紫外掃描圖譜

圖3 甲酸洗脫7 h紫外掃描圖譜

2.2.2 甲酸洗脫終點的目標產(chǎn)物環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量

甲酸繼續(xù)洗脫，當雜峰＜0.1時洗脫結(jié)束，圖4所示。

圖4 甲酸洗脫終點紫外掃描圖譜

圖4 結(jié)果可見，與圖1的標準品比較，在波長256～258 nm處有吸收峰，具有相同的組分;波長在300 nm處已無吸收峰，表明紅棗提取液中cAMP已充分與樹脂交換，大約用時15～18 h。

2.3 納濾膜分離對目標產(chǎn)物環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量的影響

紅棗提取液中cAMP充分與樹脂交換，收集了大量的甲酸洗脫液，為后續(xù)工藝帶來了不便，因此選用納濾膜進行濃縮，為洗脫液中目標產(chǎn)物環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的提取節(jié)省了蒸發(fā)設(shè)備、降低了能耗，同時有利于進一步分離和純化。

2.3.1 納濾后目標產(chǎn)物環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的UV結(jié)果

將1.3.2(4)加壓通過150 nm納膜過濾，分別收集截留濃縮液和納濾液(棄去液)，此時相對分子質(zhì)量200～1 000的包括目標產(chǎn)物環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的組分在濃縮液中，而小分子組分及大分子組分在納濾液(棄去液)中。納濾后做UV檢測，分析納濾膜分離截留的物質(zhì)和棄去液的組分，對分離目標產(chǎn)物環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 納濾截留前后料液的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)與標準品比較UV檢測圖譜

由圖5顯示，納濾截留濃縮液在258nm處峰型與環(huán)磷酸腺苷(cAMP)標準品相同，且含有高濃度的cAMP;納濾液(棄去液)在258 nm處吸收峰較小，檢測不出cAMP。表明納濾截留目標產(chǎn)物環(huán)磷酸腺苷(cAMP)效果明顯，利于cAMP分離和純化。

2.3.2 納濾后目標產(chǎn)物環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的HPLC結(jié)果

根據(jù)2.3.1的方法，做納濾后目標產(chǎn)物環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的HPLC檢測，分析納濾膜分離截留的物質(zhì)和棄去液的組分，對分離目標產(chǎn)物環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量的影響，如圖6～圖8所示。

圖6 標準品環(huán)磷酸腺苷(cAMP)HPLC色譜圖

圖7 納濾截留濃縮液中的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)HPLC色譜圖

圖8 納濾液(棄去液)中的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)HPLC色譜圖

圖7 與圖6對比結(jié)果顯示，納濾后截流組分出峰時間在5～5.1 min，表明與標準品為同一物質(zhì)，又因截流液中包含目標產(chǎn)物環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的相對分子質(zhì)量200～1 000的組分，雜峰較多，需純化;如圖8與圖6對比顯示，納濾液(棄去液)在5～5.1 min處已經(jīng)無峰，表明沒有與標準品相同的物質(zhì)，納濾液幾乎不含cAMP;因此采用納濾技術(shù)濃縮大量甲酸洗脫液，可縮短工藝周期、降低能耗，利于目標產(chǎn)物cAMP分離和純化。

2.430 %cAMP樣品檢測結(jié)果

由1.3.2(6)得到的30% cAMP樣品按照1.3.3.2、1.3.3.3的方法檢測，結(jié)果如圖9、圖10所示。

圖930 %cAMP粗品的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)HPLC色譜圖

圖10 30%環(huán)磷酸腺苷(cAMP)粗品的TLC圖譜

圖9 顯示，離心噴霧干燥后得到的樣品HPLC在5～5.1 min的吸收峰與圖6完全相同;圖10顯示2樣品與1 cAMP標準品的Rf值相近，表明粗品即是cAMP。

利用本工藝提取的cAMP粗品為無毒、天然制品，可作為食品添加劑使用。根據(jù)需要可進一步純化應(yīng)用于醫(yī)藥原料等。

2.5 回收甲酸濃度的測定

納濾分離后棄去的甲酸量較大，需回收處理繼續(xù)使用。采用1.3.3.4的方法對回收甲酸進行測定，結(jié)果如表2所示。

表2 回收甲酸含量測定

經(jīng)統(tǒng)計學處理P＞0.05，表明回收甲酸濃度與0.5 mol/L甲酸對照品無顯著性差異，稍加調(diào)整便可循環(huán)使用，不但節(jié)省了試劑，而且避免了甲酸直接排放造成的環(huán)境污染。

3 結(jié)論

(1)采用分子納膜過濾技術(shù)，選用150 nm管式膜納濾洗脫液，截留相對分子質(zhì)量200～1 000的包含目標產(chǎn)物環(huán)磷酸腺苷(cAMP)及部分其他組分，分離出大分子組分及小分子組分，利于濃縮、純化得到環(huán)磷酸腺苷(cAMP)成品。工藝能耗量低，適于從紅棗中提取環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

(2)0.5 mol/L甲酸洗脫15～18 h后，紫外掃描圖譜在256～258 nm處的最大吸收峰與環(huán)磷酸腺苷(cAMP)標準品的峰型相同，表明甲酸能把交換到樹脂上的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)洗脫下來。

(3)納濾后截留組分經(jīng)HPLC檢測，出峰時間在5～5.1 min，與環(huán)磷酸腺苷(cAMP)標準品相近，表明為同一物質(zhì)，由于截留液中包含目標產(chǎn)物環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的相對分子質(zhì)量為200－1 000的組分，雜峰較多，需純化;納濾液(棄去液)在5～5.1 min處已經(jīng)無峰，表明沒有與環(huán)磷酸腺苷(cAMP)標準品相同的物質(zhì)，納濾液幾乎不含cAMP;因此采用納濾技術(shù)濃縮大量甲酸洗脫液，可縮短工藝周期，降低能耗，利于目標產(chǎn)物cAMP分離和純化。

(4)管式膜雖然膜比表面積小，造價高，但料液可不經(jīng)預處理，并不易堵塞，方便清洗。

(5)在納濾過程中，由于無機物和有機物在納濾膜上的濃縮滯留易于形成特殊的物質(zhì)與營養(yǎng)環(huán)境或是大分子和膠體懸浮物，有利于微生物在膜表面生長，增加滲透阻力，使膜的通透性下降，降低納濾過濾通量，使膜分離性能惡化，并導致目標產(chǎn)物的收率降低。因此使用完畢，先將膜設(shè)備中的過濾溶液頂洗干凈，用溫水沖洗20～40 min(水溫最高50℃)，進行循環(huán)清洗，通過濃縮液及滲透口排放，將出口封死并采取合適的方法保存。

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The Application of Nanofiltration in the Extraction of Jujube Cyclic Adenosinemonophosphate(cAMP)

Wang Chun-xia1，Lu Fu-ping1，Liu Yi-han1，Du Lian-xiang1，Li Ming-run2
1(Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education ，College of Bioengineering，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China)2(Tianjin Institute of Medical and Pharmaceutical Sciences，Tianjin 300020，China)

Nanofiltration was used in the extraction of cAMP from Jujube.Jujube was first soaked，then through puree，enzyme hydrolysis，filtration，resin adsorption and formic acid elution.The results showed:Nanofiltration fraction have a peak at a wavelength of 258nm by UV which was the same as the cyclic adenosine monophosphate(cAMP)standard;the Nanofiltration discard part has no peak at 258nm;HPLC showed that Nanofiltration interception fraction has the same retention time as the cyclic adenosine monophosphate(cAMP)reference，while the Nanofiltration discard liquid do not have the peak at the same time point.This indicated that nanofiltration intercepted the target product of cyclic adenosine monophosphate(cAMP)，successfully separated molecular，purified and concentrated cAMP.

nanofiltration，Intercept fraction，jujube，cAMP，concentrate

大學?？?，高級實驗師。

*天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣計劃項目(0702170)

2010－03－08，改回日期:2010－12－06