李仁杰,陳錦屏,張娜,嚴(yán)靜,王恒超

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安,710062)

超聲波輔助提取月柿原花青素及其純化

李仁杰,陳錦屏,張娜,嚴(yán)靜,王恒超

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安,710062)

研究了超聲波輔助提取月柿生理落果原花青素工藝。適宜工藝條件為:超聲波功率 150 W、提取溶液乙醇體積分?jǐn)?shù) 70%、料液比 (g∶mL)1∶12、提取時(shí)間 15 min、提取溫度 45℃。通過(guò)對(duì) 9種大孔吸附樹(shù)脂的研究,確定LS300樹(shù)脂為優(yōu)選純化樹(shù)脂。研究了原花青素在LS300樹(shù)脂上的吸附行為,靜態(tài)吸附研究表明,其吸附等溫曲線(xiàn)符合 Freundlich等溫吸附方程,吸附平衡的時(shí)間約為 5h。乙醇濃度梯度洗脫試驗(yàn)表明,原花青素主要易被體積分?jǐn)?shù) 20%、40%乙醇溶液洗脫,兩部分原花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 86.5%、92.3%。

原花青素,月柿生理落果,超聲波輔助提取,大孔吸附樹(shù)脂,純化

月柿屬于柿樹(shù)科柿屬,喬木落葉性果樹(shù)。主產(chǎn)于中國(guó)廣西壯族自治區(qū)恭城瑤族自治縣,已有 400多年的栽培、加工歷史[1]。恭城月柿現(xiàn)種植面積 0.669萬(wàn)hm2,年產(chǎn)柿餅 1萬(wàn) t。在月柿生長(zhǎng)過(guò)程中每年 7、8月都會(huì)產(chǎn)生大量的生理落果,造成資源浪費(fèi)與環(huán)境污染。由于月柿中含有大量的原花青素[2],所以可利用這些生理落果提取原花青素。原花青素是一種由黃烷醇單體縮合而成的聚多酚類(lèi)物質(zhì),原花青素具有極強(qiáng)的抗氧化等活性,已廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域[3-4]。本文利用月柿生理落果為原料,對(duì)超聲波輔助[5]提取月柿生理落果原花青素的工藝及用大孔吸附樹(shù)脂純化原花青素的工藝進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

月柿生理落果,2009年 7月采于恭城紅巖村柿園,采收后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室冷凍貯藏;原花青素標(biāo)品,天津尖峰天然產(chǎn)物公司生產(chǎn);LS46、LS100、D101、LS300、LS300B、LS306、LS600、LS610、LS800大孔吸附樹(shù)脂,陜西藍(lán)深樹(shù)脂有限公司;乙醇、鹽酸、甲醇、香草醛均為國(guó)產(chǎn)分析純。

舒美 KQ3200DE型實(shí)驗(yàn)室用超聲波清洗器 (功率 150 W,頻率 40 KHz,溫度、功率均可調(diào)),昆山超聲儀器公司;Sartorius BS224型電子天平,北京賽多利斯 (Sartorius)儀器系統(tǒng)有限公司;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;722型可見(jiàn)分光光度計(jì),上海光譜儀器有限公司;MB99-2自動(dòng)分離層析儀,上海滬西分析儀器有限公司;SHZ-82型恒溫水浴搖床,金壇市富華儀器有限公司;RZ-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海安亭實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 月柿生理落果原花青素提取工藝

月柿生理落果→組織搗碎機(jī)搗碎→準(zhǔn)確稱(chēng)取5.00 g→加入提取溶劑→超聲波輔助提取→提取液真空抽濾→真空濃縮提取液→冷凍干燥

1.2.2 原花青素提取率的計(jì)算

Y:原花青素的提取率,%;V0:提取溶液的體積,mL;c0:提取溶液原花青素的濃度,mg/mL;m0:月柿落果質(zhì)量,g;Z:原花青素提取效果,mg/g。

1.2.3 樹(shù)脂靜態(tài)吸附試驗(yàn)流程

將一定質(zhì)量預(yù)處理好的樹(shù)脂加入錐形瓶中,加入原花青素提取液,密封,置于水浴搖床中,進(jìn)行吸附試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定溶液中原花青素的濃度。

吸附試驗(yàn)完成后將樹(shù)脂與原花青素分離 (樹(shù)脂繼續(xù)留在錐形瓶中),在錐形瓶中加入洗脫溶液,密封,置于水浴搖床中進(jìn)行解吸試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定溶液中原花青素的濃度。

1.2.4 樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)流程

將預(yù)處理好的樹(shù)脂濕法裝柱,加入原花青素提取溶液。待原花青素充分吸附后,用蒸餾水將沒(méi)有吸附的原花青素沖出,然后用不同乙醇濃度的洗脫液進(jìn)行梯度洗脫,收集洗脫液,將洗脫液真空濃縮、冷凍干燥,并測(cè)定原花青素濃度。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

取濃度分別為 0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL的原花青素甲醇溶液 1 mL于具塞試管中,各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1%的香草醛甲醇溶液 2.5 mL與 8%的鹽酸甲醇溶液 2.5 mL,用橡皮塞塞緊試管,置于 30℃水浴鍋中避光保溫 30 min,保溫結(jié)束后冷卻至室溫,在500 nm下測(cè)量吸光值[6],并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得到回歸方程為:y=0.001 6x-0.006,R2=0.997 4。

圖 1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2 超聲波功率單因素試驗(yàn)

選擇超聲功率為 90、105、120、135、150 W 5個(gè)單因素進(jìn)行試驗(yàn),其他實(shí)驗(yàn)條件為:溫度 55℃、提取時(shí)間 10 min、提取液乙醇體積分?jǐn)?shù) 50%、料液比 1∶12。

圖 2 超聲功率單因素試驗(yàn)

從圖 2中可以看出,當(dāng)超聲波功率為 90～150 W時(shí),提取率逐漸升高,這可能是由于超聲波功率增大加快了植物細(xì)胞的破碎,更有利于原花青素的提取[5]。

2.3 提取溶液乙醇濃度單因素試驗(yàn)

原花青素的分子中含有大量羥基,易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑,但有機(jī)溶劑滲透性較差,通常選擇有機(jī)溶劑的水溶液作為提取溶劑[7],本試驗(yàn)選擇毒性較低的乙醇水溶液作為提取溶劑。

選擇提取溶液乙醇體積分?jǐn)?shù)為 40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%5個(gè)單因素進(jìn)行試驗(yàn),其他的實(shí)驗(yàn)條件為:提取溫度 55℃、提取時(shí)間 15 min、超聲波功率 150 W、料液比 1∶12。

從圖 3中可以看出,隨著乙醇濃度的增大原花青素提取率逐漸增大,但乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò) 70%后,提取率隨乙醇濃度的升高逐漸降低。

2.4 提取時(shí)間單因素試驗(yàn)

選擇提取時(shí)間 5 min、10 min、15 min、20 min、25 min 5個(gè)單因素進(jìn)行試驗(yàn),其他實(shí)驗(yàn)條件為:超聲波功率 150 W、提取溫度 55℃、提取溶液乙醇濃度70%、料液比 1∶12。

圖 3 提取溶劑乙醇濃度單因素試驗(yàn)

圖 4 提取時(shí)間單因素試驗(yàn)

從圖 4中可以看出,當(dāng)提取時(shí)間為 15 min時(shí)提取率最高,15 min以后隨著提取時(shí)間的增加提取率隨著時(shí)間的增加反而降低。這可能是由于較短的提取時(shí)間不能使原花青素得到充分浸提,較長(zhǎng)的提取時(shí)間又會(huì)造成原花青素氧化分解的緣故。

2.5 料液比單因素試驗(yàn)

選擇液料比 1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16進(jìn)行單因素試驗(yàn),其他試驗(yàn)條件為:超聲波功率150W、提取溫度 55℃、提取溶液乙醇體積分?jǐn)?shù) 70%、提取時(shí)間 15 min。

從圖 5中可以看出,隨著液料比的增大,提取率逐漸增大,液料比為 12∶1時(shí)提取效果達(dá)到最大,液料比繼續(xù)增大提取率則開(kāi)始下降。這可能是由于較小的液料比無(wú)法充分浸提出原花青素,較大的料液比造成了液體過(guò)多地吸收了超聲波使,使作用于原料的超聲波減小的緣故。

2.6 提取溫度單因素試驗(yàn)

圖 5 料液比單因素試驗(yàn)

選擇 25、35、45、55、65℃5個(gè)溫度為單因素進(jìn)行試驗(yàn),其他實(shí)驗(yàn)條件為超聲波功率 150 W、提取時(shí)間15 min、提取溶液乙醇體積分?jǐn)?shù) 70%、料液比 1∶12。

從圖 6可知,隨著溫度的升高,提取率不斷增大,到 55℃時(shí)提取率達(dá)到最大,繼續(xù)升高溫度,則提取率開(kāi)始下降?？赡苁怯捎跍囟壬呒铀偌?xì)胞破裂并有利于原花青素充分溶解于提取溶液,但原花青素是熱敏性物質(zhì),高溫又會(huì)使其分解加快的緣故。

圖 6 提取溫度單因素試驗(yàn)

2.7 超聲波輔助提取正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇提取溫度 (A)、提取時(shí)間 (B)、料液比 (C)三因素在三個(gè)水平上進(jìn)行正交試驗(yàn),試驗(yàn)中其他試驗(yàn)條件為超聲功率 150 W、提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù) 70%。

從表 2中可以看出,原花青素最佳提取條件為A1B2C2,由此得出最佳提取條件為:提取溫度 45℃、提取時(shí)間 15 min、料液比為 1∶12、超聲波功率 150W、提取溶劑乙醇濃度 70%。從極差分析可以看出 3個(gè)因素對(duì)原花青素提取效果影響的主次順序?yàn)?B(提取時(shí)間)>C(料液比)>A(提取溫度)。

表1 L9(33)正交因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表3 正交試驗(yàn)方差分析

從表 3中可以看出,A(提取溫度)、B(提取時(shí)間)、C(料液比)3個(gè)因素對(duì)提取效果的影響均顯著。

2.8 大孔吸附樹(shù)脂選擇試驗(yàn)

試驗(yàn)選擇 LS46、LS100、D101、LS300、LS300B、LS306、LS600、LS610、LS800九種大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行樹(shù)脂選擇試驗(yàn),從中選擇一種吸附能力與解吸能力俱佳的樹(shù)脂。

各加入上述 9種樹(shù)脂 10 g于錐形瓶中,分別加入 20 mL濃度為 0.226 3 mg/mL原花青素溶液,將錐形瓶置于水浴搖床中進(jìn)行吸附試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)條件為:溫度 40℃、轉(zhuǎn)速 120 r/min、時(shí)間 24 h。然后測(cè)定溶液中原花青素濃度 c1。將樹(shù)脂與原花青素溶液分離 (樹(shù)脂繼續(xù)保留在錐形瓶中),加入乙醇體積分?jǐn)?shù)為 50%洗脫液 20 mL,在水浴搖床中進(jìn)行解吸試驗(yàn),試驗(yàn)條件為:溫度 40℃、轉(zhuǎn)速 120 r/min、時(shí)間 24 h,然后測(cè)定洗脫液中原花青素濃度 c2。計(jì)算各樹(shù)脂吸附能力與解吸率。

W:樹(shù)脂吸附能力,mg/g;m1:樹(shù)脂質(zhì)量,g;n:樹(shù)脂解吸率,%。

表4 樹(shù)脂型號(hào)與樹(shù)脂編號(hào)

圖 7 樹(shù)脂選擇試驗(yàn)

從圖 7中可以看出,吸附能力最強(qiáng)的是 5號(hào)樹(shù)脂即 LS300B樹(shù)脂,但 LS300B樹(shù)脂解吸率太低,會(huì)造成吸附上去的原花青素?zé)o法被洗脫下來(lái),所以綜合吸附能力與解吸率,選擇 4號(hào)樹(shù)脂即 LS300樹(shù)脂繼續(xù)進(jìn)行原花青素純化的實(shí)驗(yàn)。

2.9 吸附速率試驗(yàn)

在錐形瓶中加入 5 g處理好的 LS300樹(shù)脂,然后分別加入初始濃度分別為 1.87、3.52、6.82 mg/mL原花青素提取液,置于 40℃的水浴搖床中震蕩 (120 R/min),每隔 1h測(cè)定錐形瓶?jī)?nèi)的原花青素濃度,計(jì)算原花青素在樹(shù)脂上的吸附量。

Q:原花青素在樹(shù)脂上的吸附量 mg/g,c:溶液原花青素的初始濃度 mg/mL,c4:t時(shí)刻原花青素溶液濃度 mg/mL,V1:溶液的體積 mL。

圖8 吸附速率試驗(yàn)

從圖 8中可以看出,在吸附初始階段吸附量增加明顯,吸附較快,隨后吸附量增加逐漸減慢,吸附 5 h后吸附量趨于穩(wěn)定,故吸附平衡所需時(shí)間為 5 h。

2.10 吸附平衡試驗(yàn)

稱(chēng)取 5 g樹(shù)脂加入到錐形瓶中,分別加入不同濃度的原花青素提取液 100 mL,置于恒溫?fù)u床中震蕩實(shí)驗(yàn)條件為:溫度 40℃、轉(zhuǎn)速 120 r/min、時(shí)間 6 h。6 h后取出測(cè)定溶液中原花青素的濃度。測(cè)定 30、40、50、60℃時(shí)的吸附等溫曲線(xiàn)。用 Freundlich方程:Q=kc1/n擬合所得數(shù)據(jù)[8]。

圖 8 吸附平衡試驗(yàn)

表5 Freundlich等溫吸附方程擬合結(jié)果

2.11 動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)

取預(yù)處理好的 LS300樹(shù)脂 120 g濕法裝柱 (2.5 cm×60 cm),緩慢加入濃度為 6.57 mg/mL原花青素水溶液,流速 1BV/h(1BV相當(dāng)于 1倍層析柱的體積,單位:mL)、溫度 30℃,收集流出液,每管 10 mL,測(cè)定其中原花青素的濃度。以流出液體積為 x軸,以流出液原花青素濃度為 y軸,繪制泄露曲線(xiàn)。

圖 9 泄露曲線(xiàn)

從圖 9中可以看出,當(dāng)流出體積為 70 mL的時(shí)候,流出液的原花青素濃度顯著增大,此時(shí)原花青素開(kāi)始泄露,樹(shù)脂吸附達(dá)到飽和。由泄露曲線(xiàn)計(jì)算LS300飽和吸附量為 3.833 mg/g,與 Freundlich等溫吸附方程計(jì)算的結(jié)果的飽和吸附量 4.585 mg/g相比較低,說(shuō)明柱中的樹(shù)脂還沒(méi)有達(dá)到飽和吸附,使得動(dòng)態(tài)吸附量偏低。

2.12 動(dòng)態(tài)解吸

取預(yù)處理好的 LS300樹(shù)脂 250 g濕法裝柱 (2.5 cm×60 cm),緩慢加入 100 mL原花青素濃度為 7.24 mg/mL水溶液,流速 0.5 BV/h,然后加入 3BV的去離子水將未吸附的原花青素及蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)頂替出去,流速 1BV/h。然后按順序分別加入 2BV乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為 20%、40%、60%、80%、100%溶液進(jìn)行梯度洗脫[9-12],流速為 0.5 BV/h。收集各部分洗脫液,減壓濃縮并冷凍干燥后測(cè)定各部分洗脫液中原花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù) (簡(jiǎn)稱(chēng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)),并計(jì)算每部分洗脫液中原花青素的量占總洗脫原花青素量的比例 (簡(jiǎn)稱(chēng)比例)。

表6 不同濃度乙醇濃度溶液梯度洗脫的各組分含量、比率

由表 6可以看出,洗脫出的原花青素主要集中在20%、40%2個(gè)組分中,2組分原花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 86.5%、92.3%,原花青素純度還不夠高,洗脫條件有待優(yōu)化。

3 結(jié)論

超聲波輔助提取月柿落果原花青素的適宜工藝條件為:超聲波功率 150 W、提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比 1∶12、提取時(shí)間 15 min、提取溫度 45℃。用此工藝條件提取的月柿原花青素在 LS300大孔吸附樹(shù)脂上的吸附行為符合 Freundlich等溫吸附方程。吸附量隨溶液的濃度增大和吸附時(shí)溫度的升高而增加,達(dá)到吸附平衡的時(shí)間約為 5 h。用乙醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫,洗脫下來(lái)的原花青素主要集中在 20%、40%2個(gè)組分中,其中 20%洗脫組分原花青素含量為86.5%,40%洗脫組分原花青素含量為 92.3%,原花青素純度還不夠高,洗脫條件有待優(yōu)化。

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Ultrason ic Extraction and Purification of Proanthocyan idins from Persimmon

Li Ren-jie,Chen Jin-ping,Zhang Na,Yan Jing,Wang Heng-chao
(College of Food Engineering and Nutritional Science of ShaanxiNormalUniversity,Xi’an 710062,China)

The opti mum ultrasonic extraction process of proanthocyanidinswas studied.Opti mal extracting condition was confirmed as follows:the rate of powerof ultrasonic was 100%,alcohol contentwas 70%,the ratio of liquid to materialwas1∶12,the extraction timewas15mins and the extraction temperature was45℃.ChooseLS300 resin as the material for the purification.The absorbability ofLS300 resin was studied.The results of static adsorption showed that the adsorption isother m could be correlated with Freundlich.The adsorption equilibrium time was about 5h.The experiment of concentration gradient elution by ethanol solution showed that the most proanthocyanidinswere concentrated on two parts:the 20%and 40%.The mass fractions of two partswere 86.5%and 92.3%.

proanthocyanidins,persimmon,ultrasonic extraction,macroporous resin,purification

碩士研究生 (陳錦屏教授為通訊作者)。

2010-11-19,改回日期:2011-01-08