熊 澤 徐紅霞 邵 偉 李 嘯 胡 濱 仇 敏

(1.三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,湖北宜昌 443002;2.湖北民康制藥有限司,湖北宜昌 443002)

鼻淵丸收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑第六冊第202 頁,該方是由蒼耳子、辛夷、金銀花、茜草、野菊花五味藥材制成的復(fù)方制劑,具有祛風(fēng)宣肺、清熱解毒、通竅止痛之功效,臨床用于鼻塞鼻淵,通氣不暢,流涕黃濁,嗅覺不靈,頭痛,眉棱骨痛.2006 年根據(jù)國家藥品標準提高行動計劃中成藥品種增修訂項目任務(wù)表要求,本研究在制定鼻淵丸質(zhì)量標準過程中,對照《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑第六冊第202 頁中“鼻淵丸”一章,對“鼻淵丸”質(zhì)量標準進行了修訂及提高.中藥成方制劑第六冊中對該藥僅有顯色反應(yīng)和丸劑通則檢查,為保證藥品療效,有必要建立定量分析方法,以便更好地控制藥品質(zhì)量.本研究對其處方中各味藥材進行了鑒別、分析,其主藥蒼耳子中主要含有脂肪油,而油類所含成份比較復(fù)雜,一種揮發(fā)油中常常含有幾十種到一、二百種成份,故不易做定量分析,而其另一主要成份辛夷,本研究在參考2005 年版《中國藥典》一部的基礎(chǔ)上,探索用HPLC 方法測定其活性成份木蘭脂素含量的方法,取得很好的結(jié)果.在薄層鑒別方面,制定出藥方中主藥辛夷、蒼耳子、金銀花、野菊花的薄層鑒別方法[1].

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

烘箱(DHP-781 型,湖北省黃石市醫(yī)療器械廠生產(chǎn)),紫外燈(365 nm ,上海科藝光學(xué)儀器廠生產(chǎn)),點樣器(25 μL,上海安亭微樣進量器廠生產(chǎn)).

日本島津液相色譜儀:泵LC-10A T ;檢測器SPD-M10VP;乙睛為色譜純,四氫呋喃,甲醇、乙醇為分析純,水為重蒸餾水.

鼻淵丸(批號為060301、060302、060303)由湖北民康制藥有限公司提供.

木蘭脂素對照品(批號:882-200102),綠原酸對照品(批號:110753-200413),兩種對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供.

1.2 定性鑒別方法

1.2.1 辛夷

取本品3.0g,研成細粉,加乙酸乙酯30mL,浸泡20 min 后,超聲處理10 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇1 mL 使溶解,作為供試品溶液.取辛夷花對照藥材0.5 g ,同法制成對照藥材溶液.另取木蘭脂素對照品,加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液,作為對照品溶液.照薄層色譜法(中國藥典2005 版一部附錄V I B)試驗,吸取上述三種溶液各5 μL ,分別點于同一硅膠G 薄層板上,以二氯甲烷-乙酸乙酯(9 ∶1)為展開劑,展開,取出, 晾干, 噴以10%硫酸乙醇溶液, 在90 ℃加熱至顯色清晰.

1.2.2 蒼耳子

取本品適量,研細,稱取5 g,加甲醇30 mL,超聲處理30 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加水適量使溶解,加于已處理好的D101 型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑10 ～15 mm ,濕法裝柱5 cm,水50mL 預(yù)洗)上,先用水100 mL 洗脫,棄去水洗液,再用20%甲醇100 mL 洗滌,收集甲醇洗脫液,蒸干,殘渣加甲醇1 mL 使溶解,作為供試品溶液.另取蒼耳子對照藥材2 g,加50%甲醇40 mL 回流提取2 h,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇20 mL 微熱使溶解,濃縮至約2 mL ,濾過,濾液作為對照藥材溶液.照薄層色譜法(中國藥典2005 年版一部附錄VI B)試驗,吸取上述兩種溶液各10 μL,分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G 薄層板上,以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水-甲酸(3 ∶10 ∶2 ∶2 ∶2)的下層溶液(2 ～10 ℃放置過夜)為展開劑,展開,取出,晾干,置碘蒸氣中顯色.

1.2.3 金銀花、野菊花

取本品細粉5 g,用水濕潤,加醋酸乙酯20 mL ,超聲處理5 min,棄去醋酸乙酯液,殘渣自“加醋酸乙酯20 mL”起同法重復(fù)處理1 次,殘渣加入1 mol/L 鹽酸5 滴,加醋酸乙酯20mL,超聲處理5 min,取醋酸乙酯液,殘渣自“加醋酸乙酯20 mL”起同法重復(fù)處理2次,合并醋酸乙酯液,蒸干,殘渣用1mL 乙醇溶解,作為供試品溶液.另取綠原酸對照品,加乙醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液,作為對照品溶液.照薄層色譜法(《中國藥典》2005 年版一部附錄VIB)試驗,吸取上述兩種溶液各1 μL ,分別點于同一聚酰胺薄膜上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(1 ∶15 ∶1 ∶1 ∶2)的上層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視.

1.3 HPLC法測定木蘭脂素含量

1.3.1 色譜條件

色譜柱COSM OSIL PACKED COLUM N for HPLC C18 250*4.6 mm ,5 μm;流動相:乙睛-四氫呋喃-水(38 ∶2 ∶62)[2-3];流速1.0 mL/min;檢測波長278 nm;進樣量10 μL .

1.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取在60 ℃減壓干燥至恒重的木蘭脂素對照品適量,加甲醇制成每1 mL 含木蘭脂素15 μg 的溶液,即得對照品溶液.

1.3.3 供試品溶液制備[4-5]

取重量差異項下本品,研細,取約5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加甲醇25 mL, 密塞, 稱定重量,超聲處理20 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液5 mL,加于中性氧化鋁柱(100-200 目2 g,內(nèi)徑10 mm,濕法裝柱,用甲醇預(yù)洗)上,用甲醇洗脫,收集洗脫液,置25 mL 量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45 μm)濾過,即得供試品溶液.

1.3.4 陰性對照溶液的制備

按質(zhì)量標準中處方比例配成缺辛夷藥材的樣品,然后按供試品溶液的制備方法,制成陰性對照溶液.

1.3.5 標準曲線繪制

精密稱取在60 ℃減壓至恒重的木蘭脂素對照品15 mg,用甲醇溶解并定容至100mL(0.15 mg/mL)搖勻,再分別精密量取1 mL ,4 份,制成5 個不同濃度的標準品溶液(0.006 04,0.015 10,0.030 20,0.075 50,0.151 0mg/mL),分別精密吸取上述各溶液10μL,按色譜條件測定峰面積,以峰面積積分值為縱坐標,木蘭脂素的進樣量為橫坐標,繪制曲線,計算得回歸方程.

1.3.6 回收率試驗

采用加樣回收法精密稱取5 g 已知含量、同一批號鼻淵丸(重復(fù)性試驗樣品0.32 mg/g)粉末6 份,分別加入對照品(0.2 mg/mL)各8.0 mL,按供試品溶液制備和樣品測定項下方法操作,用1.3.1 色譜條件測定,結(jié)果見表2.

1.3.7 樣品測定

精密稱取以下10 個批號濃縮鼻淵丸粉末5.0 g,按供試品溶液的制備和樣品的測定項下方法操作測定,在上述色譜條件下,對十批樣品進行測定,以確定本品木蘭脂素含量下限.

2 結(jié)果與分析

2.1 定性鑒別結(jié)果

2.1.1 辛夷

供試品色譜圖中,在與對照藥材、對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點.Rf 值較好.陰性對照液無對應(yīng)斑點,如圖1 所示.

圖1 辛夷TLC 鑒別

2.1.2 蒼耳子

供試品色譜圖中,在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點.Rf 值較好.陰性對照液無對應(yīng)斑點,如圖2 所示.

圖2 蒼耳子T LC 鑒別

2.1.3 金銀花、野菊花

供試品色譜圖中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點.Rf 值較好.陰性對照液無對應(yīng)斑點,如圖3 所示.

圖3 金銀花、野菊花T LC 鑒別

2.2 木蘭脂素含量測定(HPLC法)

由圖5 樣品HPLC 圖知,木蘭脂素主峰與周圍各峰間分離度大于2,且峰形對稱,理論塔板數(shù)在6 000 以上,陰性實驗無干擾.

2.2.1 線性關(guān)系考察

結(jié)果見表1,以峰面積積分值為縱坐標,木蘭脂素的進樣量為橫坐標,繪制曲線(見圖4)計算得回歸方程:Y =640 076.44X -3 888.08,r=0.999 9,表明木蘭脂素在0.060 4 ～1.510 0 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系.

表1 進樣量與峰面積對應(yīng)關(guān)系

圖4 線性關(guān)系考察

圖5 樣品H PLC 圖

2.2.2 精密度試驗

取木蘭脂素對照品溶液,重復(fù)進樣6 次,記錄峰面積為164 390、165 436、163 329、165 859、163 430、166 478,結(jié)果RSD 為0.79%.

2.2.3 重復(fù)性試驗

取同批丸劑磨碎,精密稱取適量6 份,按供試品溶液制備項下方法處理,按上述色譜條件分析測定,結(jié)果為0.325 3、0.320 7、0.320 4、0.321 5、0.322 1、0.320 1(mg/g),RSD 為0.6%.

2.2.4 穩(wěn)定性試驗

取同一對照品溶液,在0,4,8,16,24 hr 分別進樣,記錄峰面積為144 923、143 756、145 287、145 641、143 835,RSD 為0.6%.

2.2.5 回收率試驗

結(jié)果見表2.

表2 回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.2.6 樣品測定

結(jié)果見表3.

表3 10 批樣品的木蘭脂素含量測定(n=2)

根據(jù)10 批樣品含量測定數(shù)據(jù)及藥材的藥典標準,制訂本品含量限度為:本品每克含辛夷以木蘭脂素(C23H28O7)計,不得少于0.24 mg .即本品每丸含辛夷以木蘭脂素(C23H28O7)計,不得少于0.048 mg .

3 討 論

鼻淵丸中木蘭脂素含量分析由于存在多種藥材成分,其測定的干擾較大,進而影響到色譜條件的選擇.在本研究擬定的色譜條件下,鼻淵丸中木蘭脂素峰與其它成分的峰能有效的分離,分離度及精密度均符合《中國藥典》要求,重現(xiàn)性及線性關(guān)系良好,回收率達標,故本法可行.

[1] 國家藥典委員會.中國藥典2005 年版[ S] .一部, 2005:30-31, 126-127, 152-154.

[2] 張 鷹, 程 璐, 張 耕.高效液相色譜法測定鼻通合劑中木蘭脂素的含量[ J] .醫(yī)藥導(dǎo)報,2009,28(7):929-930.

[3] 周 琦, 辛俐華.H PLC 法測定鼻淵丸中木蘭脂素的含量[ J] .中國藥師, 2006,9(3):213-215.

[4] 方 紅, 郭 群, 蘇 瑋, 等.高效液相色譜法測定中藥辛夷中木蘭脂素的含量[ J] .藥物分析雜志, 2002, 22(5):342-345.

[5] 楊曉潁.高效液相色譜法測定鼻淵丸中木蘭脂素含量[ J] .中國藥業(yè), 2004,13(8):40.