戚仁莉, 瞿家桂, 陳艷梅, 馬原野,, 胡新天,

(1. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 安徽 合肥 230026; 2. 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所, 云南 昆明 650223; 3. 中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所 腦與認(rèn)知國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100101; )

青春期小鼠與成年小鼠在嗎啡和食物誘導(dǎo)條件化位置偏愛(ài)建立上的異同

戚仁莉1,2, 瞿家桂1,2, 陳艷梅2, 馬原野1,2,3,*, 胡新天1,2,3,*

(1. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 安徽 合肥 230026; 2. 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所, 云南 昆明 650223; 3. 中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所 腦與認(rèn)知國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100101; )

該實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用嗎啡誘導(dǎo)的條件位置偏愛(ài)(conditioned place preference, CPP)與食物誘導(dǎo)CPP相結(jié)合的方法來(lái)研究青春期小鼠和成年小鼠的普通學(xué)習(xí)記憶和成癮學(xué)習(xí)記憶之間是否存在差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn): 1)成年小鼠能夠建立嗎啡誘導(dǎo) CPP, 而青春期小鼠不能建立; 2)青春期小鼠和成年小鼠都能夠建立食物誘導(dǎo) CPP。嗎啡誘導(dǎo) CPP的結(jié)果提示, 青春期小鼠和成年小鼠在成癮學(xué)習(xí)記憶上有差異, 青春期小鼠的成癮記憶能力較弱。食物誘導(dǎo) CPP的結(jié)果提示, 青春期小鼠和成年小鼠在普通學(xué)習(xí)記憶上沒(méi)有差異。嗎啡誘導(dǎo)CPP和食物誘導(dǎo)CPP的結(jié)果比較提示,小鼠的普通學(xué)習(xí)記憶系統(tǒng)和成癮學(xué)習(xí)記憶系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)程是不平行的。

青春期; 成年; 嗎啡; 食物; 條件化位置偏愛(ài)

藥物成癮是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。學(xué)習(xí)記憶參與藥物成癮過(guò)程(Nestler 2001; Kelley 2004)。與成癮相關(guān)的線索, 如與用藥相關(guān)的人物、地點(diǎn)或暗示等, 都可能誘導(dǎo)出覓藥和用藥行為。目前實(shí)驗(yàn)室廣泛采用條件化位置偏愛(ài)(conditioned place preference, CPP)模型來(lái)研究動(dòng)物線索誘導(dǎo)的藥物依賴行為。CPP實(shí)質(zhì)上是以巴甫洛夫條件反射為基礎(chǔ)的一種行為學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程。通過(guò)把獎(jiǎng)賞刺激與非獎(jiǎng)賞中性刺激(如某特定環(huán)境)反復(fù)聯(lián)系起來(lái)之后, 非獎(jiǎng)賞性的中性刺激便可以誘導(dǎo)出獎(jiǎng)賞效應(yīng)。藥物、食物、性活動(dòng)等獎(jiǎng)賞刺激都可以誘導(dǎo)出 CPP, 但成癮藥物誘導(dǎo)CPP所檢測(cè)的成癮記憶和食物誘導(dǎo)CPP所檢測(cè)的普通記憶可能是兩個(gè)不同甚至相拮抗的記憶系統(tǒng)。之前我們實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)大鼠腹腔注射阻斷學(xué)習(xí)記憶的東莨菪堿明顯抑制了食物誘導(dǎo) CPP的建立, 但是對(duì)于嗎啡誘導(dǎo) CPP不僅沒(méi)有抑制作用,而且高劑量下還具有強(qiáng)化作用(Tan et al, 2007)。在CPP條件訓(xùn)練后, 藥物誘發(fā)大鼠的癲癇持續(xù)狀態(tài)會(huì)阻斷大鼠食物誘導(dǎo)CPP的建立, 但對(duì)嗎啡誘導(dǎo)CPP卻沒(méi)有影響(Zhang et al, 2009)。

學(xué)習(xí)記憶系統(tǒng)是隨神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育而不斷完善的。青春期是一個(gè)特殊的發(fā)育階段, 嚙齒類動(dòng)物青春期大約是從出生后28～42 d(Spear et al, 1983)。這個(gè)時(shí)期的嚙齒類動(dòng)物前額葉中有大量NMDA受體和突觸連接在消退(Guilarte, T.R., 1998), 杏仁核(Berdel et al, 1996)和海馬(Dumas & Foster, 1998; Wolfer & Lipp, 1995)尚未發(fā)育成熟, 中腦-邊緣系統(tǒng)和伏隔核的多巴胺合成水平較低(Spear, 2000)。青春期大鼠, 如出生后 35 d 的大鼠不能產(chǎn)生嗎啡誘導(dǎo)CPP效應(yīng)(.Bolanos et al,1996), 而成年大鼠就能夠產(chǎn)生嗎啡誘導(dǎo) CPP效應(yīng)(Randall et al, 1997); 但James et al(2000)研究表明, 成年與青春期大鼠的可卡因和嗎啡誘導(dǎo)CPP都可以建立, 且兩者并沒(méi)有顯著差異。嚙齒類青春期動(dòng)物是否能建立食物誘導(dǎo)CPP至今未見(jiàn)報(bào)道。在本研究中, 我們以昆明小鼠為對(duì)象, 通過(guò)比較青春期小鼠和成年小鼠嗎啡及食物誘導(dǎo) CPP的建立情況來(lái)檢測(cè)兩者的成癮記憶及普通學(xué)習(xí)記憶是否存在差異。如果青春期小鼠的嗎啡誘導(dǎo)CPP和食物誘導(dǎo)CPP都不能建立, 則說(shuō)明其成癮學(xué)習(xí)記憶和普通學(xué)習(xí)記憶系統(tǒng)均未發(fā)育完全,那么我們廣泛采用的 CPP范式將不適用于檢測(cè)青春期小鼠; 如果青春期小鼠嗎啡誘導(dǎo)CPP不能建立而食物誘導(dǎo)CPP能夠建立, 則說(shuō)明其嗎啡成癮記憶能力較弱, 而普通記憶能力正常, 那么這兩種記憶系統(tǒng)的發(fā)育進(jìn)程則是不平行的。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性昆明小鼠購(gòu)于昆明醫(yī)學(xué)院[SCXK(滇2005—0008)]。其中44只為出生后60 d以上, 開(kāi)始實(shí)驗(yàn)時(shí)體重(36.0±2.99)g; 41只為出生后23 d, 開(kāi)始實(shí)驗(yàn)時(shí)體重(18.1±2.19)g。所有動(dòng)物在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng), 12 h 黑暗交替(7:00—19:00為光周期)。實(shí)驗(yàn)在9:00—16:00之間完成。

1.2 藥品

鹽酸嗎啡(10 mg/（mL·瓶）, 沈陽(yáng)制藥廠, 產(chǎn)品批號(hào): 070802)

1.3 實(shí)驗(yàn)裝置與方法

1.3.1 CPP裝置 4個(gè)CPP箱, 由PVC板制作。CPP箱主要由兩端兩個(gè)相同尺寸(17 cm×15 cm×20 cm)的條件化箱和一個(gè)中間過(guò)渡箱(6 cm×15 cm×20 cm)組成。兩個(gè)條件化箱內(nèi)分別貼有黑白相間的橫條紋和豎條紋, 且箱底部的粗糙程度有明顯的差別, 一個(gè)粗糙; 另一個(gè)光滑。過(guò)渡箱內(nèi)為灰色內(nèi)壁。在兩個(gè)條件化箱和過(guò)渡箱之間有可以開(kāi)啟和關(guān)閉的門。通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明, 此行為檢測(cè)裝置不會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物先天性的位置偏愛(ài), 統(tǒng)計(jì)上無(wú)差異。CPP裝置被放置在單獨(dú)的房間內(nèi), 裝置上方懸掛有攝像頭,用于記錄CPP實(shí)驗(yàn)過(guò)程并保存在電腦內(nèi)。實(shí)驗(yàn)記錄的數(shù)據(jù)采用實(shí)驗(yàn)室自編軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法和過(guò)程 小鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境一周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。成年小鼠被隨機(jī)分為4組: 嗎啡組(n=12)、鹽水組(n=10)、食物組(n=11)、食物對(duì)照組(n=11); 青春期小鼠被隨機(jī)分為 4組: 嗎啡組(n=10)、鹽水組(n=9)、食物組(n=11)、食物對(duì)照組(n=11)。

1.3.2.1 嗎啡誘導(dǎo)的CPP實(shí)驗(yàn)程序

1)條件化前期(第 1～3 d): 也稱適應(yīng)期, 打開(kāi)CPP箱小門, 每天小鼠在CPP箱內(nèi)自由活動(dòng)15 min (900 s)。第3天 動(dòng)物在CPP箱內(nèi)的行為被錄像并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。如果動(dòng)物出現(xiàn)明顯的位置偏愛(ài), 如在一個(gè)箱內(nèi)停留的時(shí)間超過(guò)總時(shí)間(900 s)的70%(630 s)或少于總時(shí)間的 30%(270 s), 該動(dòng)物將會(huì)被剔除。選擇動(dòng)物停留時(shí)間相對(duì)較短的箱子為伴藥箱與嗎啡相匹配。

2)條件化期(第4～11天)：在此期間, 條件化箱門關(guān)閉, 小鼠每天在腹腔注射嗎啡(40 mg/kg體重)或等體積生理鹽水后, 立即進(jìn)入所配對(duì)的箱子, 停留40 min。嗎啡組小鼠進(jìn)入伴藥箱前腹腔注射嗎啡,進(jìn)入無(wú)伴藥箱前腹腔注射鹽水; 鹽水組小鼠進(jìn)入伴藥箱和無(wú)伴藥箱前都注射鹽水。每天條件化訓(xùn)練一次。

3)條件化后期(第12天): 將CPP箱的小門打開(kāi),小鼠在箱內(nèi)自由活動(dòng)15 min(900 s)并錄像。

1.3.2.2 食物誘導(dǎo)的CPP實(shí)驗(yàn)程序

實(shí)驗(yàn)前統(tǒng)計(jì)小鼠每天的食物消耗量并得出其基礎(chǔ)值, 實(shí)驗(yàn)前 5 d 及實(shí)驗(yàn)期間限制小鼠攝食量(給予基礎(chǔ)值85%的食物)。條件化前期(第1～3天)和條件化后期(第10天)與嗎啡CPP程序相同。條件化期間(第4～9天), 條件化箱門關(guān)閉, 小鼠隔天進(jìn)入伴食箱或無(wú)伴食箱接受40 min條件化訓(xùn)練。食物組小鼠訓(xùn)練時(shí), 伴食箱提供 5 g 食物, 無(wú)伴食箱不提供食物; 對(duì)照組小鼠訓(xùn)練時(shí), 伴食箱和無(wú)伴食箱均不提供食物。食物組小鼠在伴食箱的訓(xùn)練結(jié)束后, 對(duì)剩余食物稱重。每天條件化訓(xùn)練一次。

每次小鼠實(shí)驗(yàn)后, 取出箱子下面的底板, 用水清洗, 再使用酒精擦拭底板和箱子的四壁, 間隔 10 min 后再進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

CPP效應(yīng)的考察指標(biāo)采用CPP評(píng)分, CPP分?jǐn)?shù)計(jì)算公式為伴藥(食)箱停留的時(shí)間/[伴藥(食)箱停留的時(shí)間+無(wú)伴藥(食)箱停留的時(shí)間]。數(shù)據(jù)用 CPP分?jǐn)?shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)表示, 對(duì)訓(xùn)練前后的CPP分?jǐn)?shù)采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析(Hnasko et al, 2005; Airavaara et al, 2007), 應(yīng)用軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為在統(tǒng)計(jì)上有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 青春期小鼠與成年小鼠在嗎啡CPP上的差異

小鼠適應(yīng)期后進(jìn)行連續(xù)8 d的嗎啡條件位置匹配訓(xùn)練, 通過(guò)配對(duì)比較條件化訓(xùn)練前期與訓(xùn)練后期的CPP分?jǐn)?shù)來(lái)考察小鼠能否建立嗎啡誘導(dǎo)CPP效應(yīng)。結(jié)果表明: 青春期鹽水組小鼠 條件化前期與條件化后期分?jǐn)?shù)沒(méi)有顯著差異(t=-1.654,P=0.133),青春期嗎啡組小鼠條件化前期與條件化后期分?jǐn)?shù)也沒(méi)有顯著差異(t=-1.056,P=0.318), 說(shuō)明青春期小鼠在本實(shí)驗(yàn)使用的嗎啡劑量下不能產(chǎn)生嗎啡誘導(dǎo)的CPP效應(yīng)(圖1a)。成年鹽水組小鼠條件化前期與條件化后期分?jǐn)?shù)沒(méi)有顯著性差(t=-0.786,P=0.448), 嗎啡組小鼠條件化前期與條件化后期分?jǐn)?shù)存在顯著性差異(t=-2.834,P=0.016), 說(shuō)明成年小鼠在本實(shí)驗(yàn)使用的嗎啡劑量下能產(chǎn)生嗎啡誘導(dǎo)的CPP效應(yīng)(圖1b)。

2.2 青春期小鼠與成年小鼠在食物CPP上的差異

圖1 青春期和成年小鼠的嗎啡誘導(dǎo)CPP效應(yīng)Fig. 1 Morphine-induced CPP effects in adolescent and adult mice

小鼠適應(yīng)期后進(jìn)行連續(xù)6 d的食物條件化位置匹配訓(xùn)練, 通過(guò)配對(duì)比較條件化訓(xùn)練前期與訓(xùn)練后期的CPP分?jǐn)?shù)來(lái)檢測(cè)小鼠能否建立食物CPP效應(yīng)。結(jié)果表明: 青春期食物對(duì)照組小鼠條件化前期與條件化后期分?jǐn)?shù)沒(méi)有顯著差異(t=-1.268,P=0.237),青春期食物組小鼠條件化前期與條件化后期分?jǐn)?shù)具有顯著差異(t=-2.477,P=0.033), 說(shuō)明青春期小鼠能產(chǎn)生食物CPP效應(yīng)(圖2a)。成年食物對(duì)照組小鼠條件化前期與條件化后期分?jǐn)?shù)沒(méi)有顯著性差異(t=-0.708,P=0.494), 成年食物組小鼠條件化前期與條件化后期分?jǐn)?shù)存在顯著性差異(t=-3.057,P=0.011), 說(shuō)明成年小鼠也能產(chǎn)生很好的食物 CPP效應(yīng)(圖2, b)。

圖2 青春期和成年小鼠的食物誘導(dǎo)CPP效應(yīng)Fig. 2 Food-induced CPP in adolescent and adult mice

3 討 論

青春期小鼠和成年小鼠經(jīng)過(guò)連續(xù)6 d食物配對(duì)訓(xùn)練后都能夠建立食物誘導(dǎo) CPP, 說(shuō)明青春期小鼠具有將環(huán)境背景和食物獎(jiǎng)賞效應(yīng)聯(lián)合起來(lái)記憶的能力, CPP范式能夠用于對(duì)檢測(cè)青春期小鼠; 經(jīng)過(guò)連續(xù)8 d嗎啡配對(duì)訓(xùn)練后, 青春期小鼠不能建立嗎啡誘導(dǎo) CPP, 而成年小鼠能夠建立。從青春期小鼠與成年小鼠的嗎啡誘導(dǎo)CPP和食物誘導(dǎo)CPP結(jié)果的比較中可以看出, 青春期小鼠與成年小鼠在普通學(xué)習(xí)記憶上沒(méi)有差異, 而在成癮學(xué)習(xí)記憶上存在差異, 青春期小鼠成癮記憶要弱于成年小鼠; 且在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中, 成癮學(xué)習(xí)記憶和普通學(xué)習(xí)記憶這兩個(gè)學(xué)習(xí)記憶系統(tǒng)的發(fā)育進(jìn)程是不平行的。

青春期小鼠與成年小鼠相比成癮學(xué)習(xí)記憶能力較弱的特點(diǎn), 可能是機(jī)體在發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)保護(hù)措施。之前有實(shí)驗(yàn)支持這一觀點(diǎn), Doherly et al 2009)對(duì)成年大鼠與青春期大鼠的自我給藥、戒斷和線索誘導(dǎo)復(fù)吸過(guò)程進(jìn)行對(duì)比研究發(fā)現(xiàn), 青春期大鼠與成年大鼠在自我給藥劑量方面沒(méi)有差異, 但在戒斷后線索誘導(dǎo)的覓藥行為上不如成年大鼠明顯, 提示在個(gè)體發(fā)育的過(guò)程中, 青春期機(jī)體消除傷害刺激的保護(hù)機(jī)制比成年期機(jī)體更強(qiáng)。另外, 從進(jìn)化的角度來(lái)看, 普通學(xué)習(xí)記憶能力是物種得以保存的基本能力, 所以在個(gè)體發(fā)育的早期就已具備, 而成癮學(xué)習(xí)記憶相對(duì)于生存來(lái)說(shuō)是比較高級(jí)的能力,其發(fā)育進(jìn)程滯后于普通學(xué)習(xí)記憶系統(tǒng)是可以理解的。

Airavaara M, Tuomainen H, Piepponen TP, Saarma M, Ahtee L. 2007. Effects of repeated morphine on locomotion, place preference and dopamine in heterozygous glial cell line-derived neurotrophic factor knockout mice [J].Genes Brain Behav,6(3): 287-298.

Berdel B, Morys J，Macie jewska B et a1. 1996. Acetyleholinesterase activity as a marker of maturation of the basolateral complex of the amygdaloid body in the rat [J]．Int J Dev Neurosci, 14(5): 543-549.

Bolanos CA, Garmsen GM, Clair MA, McDougall SA. 1996. Effects of the k-opioid receptor agonist U-50,488 on morphine-induced place preference conditioning in the developing rat [J].Eur J Pharmacol, 317(1): 1-8.

Campbell J O, Wood R D, Spear L P. 2000. Cocaine and morphine-induced place conditioning in adolescent and adult rats[J].Physiol Behav, 68(4): 487-493.

Doherty J, Osbomnwan Y, Williams B, et a1. 2009. Age-dependent morphine intake and cue-induced reinstatement,but not escalation in intake,by adolescent and adult male rats [J].Pharmacol Biochem Behav，92(1): 16-172．

Dumas, T.C，F(xiàn)oster, T.C. 1998. Late developmental changes in the ability of adenosine A1 receptors to regulate synaptic transmission in the hippocampus [J].Devel. Brain Res,105: 137-139.

Hnasko TS, Sotak BN, Palmiter RD. 2005.Morphine reward in dopamine-deficient mice [J].Nature.438, 854-857.

Kelley AE. 2004. Memory and addiction: shared neural circuitry and molecular mechanisms [J].Neuron, 44(1): 161-79.

Nestler EJ. 2001. Neurobiology. Total recall-the memory of addiction [J].Science,292(5525): 2266-7.

Randall CK, Kraemer PJ, Bardo MT. 1998. Morphine-induced conditioned place preference in preweanling and adult rats [J].Pharmacol Biochem Behav, 60(1): 217–222.

Spear LP. 2000.The adolescent brain and age-related behavioral manifestations [J].Neurosci Biobehav Rev,24(4): 417-63.

Spear LP, Brake SC. 1983. Periadolescence: age-dependent behavior and psychopharmacological responsivity in rats [J].Dev Psychobiol, 16(2): 83-109.

Tan H, Liu N, Wilson FA, Ma YY. 2007. Effects of scopolamine on morphine induced reward-related learning and memory [J].Addict Biol, 12(3-4): 463-9.

Wolfter DP, Lipp HP. 1995. Evidence for physiological growth of hippocampal mossy fiber collaterals in the guinea pig during puberty and adulthood [J].Hippocampus, 5: 329-340.

Zhang J, Tan H, Niu H, Wang J , Tang X, Sanford L, Ma Y. 2009. Pentylenetetrazole-induced status epilepticus following training does not impair expression of morphine-induced conditioned place preference [J].Addict Biol,14(2): 174-84.

Differences in morphine-induced and food-induced conditioned place preference between adolescent and adult mice

QI Ren-Li1,2, QU Jia-Gui1,2, CHEN Yan-Mei2, MA Yuan-Ye1,2,3,*, HU Xin-Tian1,2,3,*

(1. School of Life Science,University of Science and Technology of China,Hefei Anhui230026,PR China; 2. Kunming Institute of Zoology,the Chinese Academy of Sciences,Kunming Yunnan650223,China; 3. State Key Laboratory of Brain and Cognitive Science,Institute of Biophysics,the Chinese Academy of Science,Beijing100101,China;)

In the present study, the differences between addictive memory and ordinary memory were investigated by morphine-induced and food-induced conditioned place preference (CPP) in adolescent and adult mice. The result showed that: 1) morphine-induced CPP could be established in adult mice but not in adolescent mice. 2) food-induced CPP could be established both in adolescent and adult mice. This study indicated that between adolescent and adult mice, there was no difference in ordinary memory, but for addictive memory, they were quite different. Our data suggested that the development of addictive memory and ordinary memory system in mouse brain might not be paralleled.

Adolescent; Adult; Morphine; Food; CPP

Q42; Q959.837; R338.1

A

0254-5853-(2011)05-0528-05

10.3724/SP.J.1141.2011.05528

2011-04-27；接受日期：2011-07-22

成癮學(xué)習(xí)記憶與成癮學(xué)習(xí)記憶有何不同？（30870825）

?通訊作者(Corresponding authors)，E-mail: yuanma0716@vip.sina.com; xthu@mail.kiz.ac.cn