尹秀蓮 游慶紅，2

（1.淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 淮安 223001；2.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 210009）

超聲輔助復(fù)合酶法提取桑黃多糖

尹秀蓮1游慶紅1，2

（1.淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 淮安 223001；2.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 210009）

探索超聲輔助復(fù)合酶法提取桑黃多糖的最佳工藝。以多糖提取收率為指標(biāo)，對(duì)超聲時(shí)間、復(fù)合酶用量、作用時(shí)間、酶解溫度及pH進(jìn)行單因素試驗(yàn)研究。結(jié)果表明：超聲輔助復(fù)合酶法提取桑黃多糖的最佳條件為超聲時(shí)間300s、固定pH 4.0，應(yīng)用2.0%的木瓜蛋白酶、果膠酶和纖維素酶50℃酶解90min后，多糖得率可達(dá)1.46%。該提取工藝多糖提取收率高，可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

超聲；復(fù)合酶法；桑黃；多糖；單因素試驗(yàn)

桑黃 （phellinus linteus）是一種珍貴的藥用真菌［1］，主要寄生在桑樹、楊樹、櫟樹等樹干上。研究［2－5］發(fā)現(xiàn)，桑黃具有極高的藥用價(jià)值，如抗癌、抗氧化、抗纖維化、增強(qiáng)免疫力、抗血管增生、降血糖等。藥理學(xué)研究［6］表明，三萜、多糖和黃酮類物質(zhì)是其活性成分，其中以多糖為主。目前，常用的桑黃多糖提取方法有熱水提取法［7］和超聲輔助提取法［8］，這兩類方法操作簡單，但時(shí)間長，提取率較低。超聲輔助復(fù)合酶提取法是現(xiàn)代中藥有效成分提取的新方法［9］，其中超聲輔助提取能夠縮短提取時(shí)間、提高提取效率［10］；復(fù)合酶提取由于反應(yīng)溫和、操作時(shí)間短、成本較低等優(yōu)勢而逐漸被應(yīng)用到多糖的提取研究中［11，12］，但應(yīng)用超聲輔助復(fù)合酶法提取桑黃多糖目前鮮見報(bào)道。

本試驗(yàn)在對(duì)桑黃超聲處理的基礎(chǔ)上，應(yīng)用復(fù)合酶法高效提取桑黃多糖，優(yōu)化最佳提取工藝，提高多糖得率，以期為桑黃多糖的研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑黃：長白山野生，吉林博苑長白山特產(chǎn)科技有限公司提供；

乙醇、濃硫酸、氯仿、正丁醇、磷酸氫二鈉、檸檬酸，苯酚等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

纖維素酶：上海伯奧生物科技有限公司；

木瓜蛋白酶、果膠酶：杰輝生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器

超聲波細(xì)胞粉碎儀：JY92－Ⅱ，寧波新芝生物科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多糖含量的測定 采用苯酚－硫酸法［13］。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮藍(lán)法［14］。

1.3.3 脫蛋白 采用Sevag法［15］。

1.3.4 多糖得率的測定 多糖得率按式（1）計(jì)算：

1.3.5 提取方法 將桑黃用蒸餾水洗凈，切片，置50℃烘箱干燥12h，取出后充分研磨成粉，備用。取一定量處理樣品，加適量蒸餾水，常溫下超聲處理一定時(shí)間后，加入pH 4.0的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液適量，調(diào)節(jié)適當(dāng)溫度，加入一定量纖維素酶、木瓜蛋白酶和果膠酶，酶解適當(dāng)時(shí)間，98℃滅酶活，10 000r／min離心5min，上清液抽濾，活性炭脫色，減壓濃縮，Sevag試劑除蛋白，濾液調(diào)節(jié)乙醇濃度至80%，靜置冷藏12h，5 000r／min離心10min，去上清液，取固形物，干燥得桑黃多糖。

1.3.6 超聲時(shí)間的優(yōu)化 取5g桑黃粉末，共5份，各加100mL蒸餾水，400W超聲波功率分別超聲處理150，200，250，300，350s后，加入pH 4.0的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液200mL，加纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶各1.5%，酶解60min，調(diào) 節(jié) pH 為 4.2、溫 度 為 60 ℃，提 取 7h，10 000r／min離心5min，上清液抽濾，活性炭脫色，減壓濃縮，Sevag試劑除盡蛋白，濾液調(diào)節(jié)乙醇濃度至80%，靜止冷藏12h，5 000r／min離心10min，去上清液，取固形物，干燥，計(jì)算桑黃多糖得率。

1.3.7 復(fù)合酶水解條件的單因素優(yōu)化

（1）復(fù)合酶作用溫度的選擇：精密稱取6份桑黃粉末5.0g，按1.3.6超聲處理后各加入pH 4.0的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液200mL，依次加入木瓜蛋白酶、果膠酶和纖維素酶各2.0%，分別在30，40，50，60，70，80℃下酶解60min后按1.3.5提取多糖，以多糖得率為指標(biāo)，優(yōu)化復(fù)合酶作用的溫度。

（2）復(fù)合酶用量的選擇：以1.3.7（1）優(yōu)化結(jié)果為基礎(chǔ)，分別加入木瓜蛋白酶、果膠酶和纖維素酶各0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，酶解60min后按1.3.5提取多糖，以多糖得率為指標(biāo)，優(yōu)化復(fù)合酶的用量。

（3）復(fù)合酶作用pH 值的選擇：以1.3.7（2）優(yōu)化結(jié)果為基礎(chǔ)，分別控制pH 值2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0酶解，以多糖得率為指標(biāo)，優(yōu)化復(fù)合酶作用的最佳pH值。

（4）復(fù)合酶作用時(shí)間的選擇：以1.3.7（3）優(yōu)化結(jié)果為基礎(chǔ)，應(yīng)用復(fù)合酶分別酶解50，70，90，110，130，150min，以多糖得率為指標(biāo)，優(yōu)化復(fù)合酶作用時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲時(shí)間的優(yōu)化

超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率有較大影響。本試驗(yàn)考察了超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響，數(shù)據(jù)均為3次試驗(yàn)結(jié)果的平均值，見表1。

表1 超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Table 1 Effect of final ultrasound time on polysaccharide yield

由表1可知，隨著超聲時(shí)間的增加，多糖得率隨之增加，但當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)300s后，多糖得率反而有所下降。這可能是由于超聲波在300s內(nèi)對(duì)細(xì)胞的破碎作用較大，多糖溶出較多，得率相應(yīng)也高；但超聲作用時(shí)間太長，其可能會(huì)破壞提取物的多糖，同時(shí)隨著超聲時(shí)間的延長，空穴效應(yīng)的作用遞減，從而使桑黃表面對(duì)多糖的吸附力增強(qiáng)。據(jù)此，本試驗(yàn)選擇超聲作用時(shí)間300s。

2.2 酶水解條件的單因素研究

2.2.1 酶作用溫度對(duì)多糖得率的影響 由圖1可知，當(dāng)酶解溫度低于50℃時(shí)，多糖得率隨溫度升高而急劇增加；當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，多糖得率隨溫度升高而快速減少。這是由于酶活力與溫度密切相關(guān)，當(dāng)溫度低于50℃時(shí)，酶活隨溫度升高而增大，多糖得率增加；而后隨著溫度的進(jìn)一步升高，造成酶失活，酶活力降低，多糖得率因而減少。

圖1 復(fù)合酶作用溫度對(duì)多糖得率的影響Figure 1 The effect of reaction combine enzyme temperature on the polysaccharide yield

2.2.2 復(fù)合酶用量對(duì)多糖得率的影響 由圖2可知，復(fù)合酶用量對(duì)多糖得率有顯著影響，當(dāng)復(fù)合酶用量低于2%時(shí)，隨著酶用量的增加，多糖得率快速增加；此后繼續(xù)加大酶用量時(shí)，多糖得率幾乎不變，甚至有所下降。這可能是由于隨著酶用量的增加部分多糖可能產(chǎn)生了降解作用，從而導(dǎo)致多糖得率略有降低。因此，確定復(fù)合酶用量為2%，此時(shí)多糖得率為1.4%。

圖2 復(fù)合酶用量對(duì)多糖得率的影響Figure 2 The effect of combine enzyme level on the polysaccharide yield

2.2.3 酶作用pH值對(duì)多糖得率的影響 由圖3可知，pH值對(duì)多糖得率有較大影響；當(dāng)pH為4.0時(shí)，多糖得率最大為1.42%；這可能是由于過酸或過堿的條件下，酶的空間結(jié)構(gòu)會(huì)受到破壞，進(jìn)而引起酶構(gòu)象及酶活的變化，影響其與底物的結(jié)合，從而使多糖得率下降。

圖3 不同酶作用pH值對(duì)多糖得率的影響Figure 3 The effect of pH value on the polysaccharide yield

2.2.4 酶作用時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 由圖4可知，復(fù)合酶作用時(shí)間對(duì)多糖得率有較大影響，當(dāng)酶作用時(shí)間為90min時(shí)，多糖得率達(dá)最大，這是由于隨著酶解時(shí)間的延長，酶解越來越完全，使得多糖得率逐步提高；之后增加酶作用時(shí)間，多糖得率基本不再增加，這是由于此時(shí)酶解已基本完全，增加酶解時(shí)間不能有效提高多糖得率，說明復(fù)合酶作用時(shí)間存在最佳值（約90min），此時(shí)多糖得率為1.46%。

圖4 不同酶作用時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Figure 4 The effect of complex enzyme reaction time on the polysaccharide yield

3 結(jié)論

（1）本試驗(yàn)以野生桑黃為原料，應(yīng)用超聲輔助復(fù)合酶法提取桑黃多糖，經(jīng)單因素試驗(yàn)得出最佳工藝：超聲300s、固定pH 4.0，應(yīng)用2.0%的木瓜蛋白酶、果膠酶和纖維素酶50℃酶解90min后，多糖得率可達(dá)1.46%，而同等條件下以熱水浸提法［7］提取桑黃多糖，其多糖提取率僅為1.133%。

（2）超聲輔助復(fù)合酶提取桑黃多糖，其中超聲、復(fù)合酶對(duì)多糖得率影響都很大，通過超聲波和復(fù)合酶的共同作用，大大促進(jìn)了桑黃多糖成分的溶出。其原因可能是超聲波能產(chǎn)生較大剪切力，再加上復(fù)合酶的酶解作用，從而使得桑黃細(xì)胞壁破裂，加速活性成分多糖的溶出，故超聲輔助復(fù)合酶提取桑黃多糖得率高于熱水浸提法。由此本試驗(yàn)將超聲法和復(fù)合酶法結(jié)合起來進(jìn)行多糖提取，試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法切實(shí)可行；該方法也能應(yīng)用于其它真菌多糖的提取；同時(shí)，采用該方法所需溫度較熱水浸提法低（因超聲本身有一定的致熱作用），故可節(jié)約能源，但超聲輔助復(fù)合酶法由于復(fù)合酶的使用導(dǎo)致成本相對(duì)熱水浸提法較高，且操作較為繁瑣。

（3）由于超聲和復(fù)合酶聯(lián)合作用可能會(huì)對(duì)提取多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的破壞作用，從而影響多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)及其生物活性等；因此，有必要對(duì)不同提取方法提取多糖的結(jié)構(gòu)及生物活性進(jìn)行比較，以得出超聲、復(fù)合酶作用到底對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了何種作用。

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Extraction technology of polysaccharides fromphellin us lin teusby ultrasonic－assisted complex enzymatic method

YIN Xiu－lian1YOU Qing－h(huán)ong1，2

（1.College of Life Sciences and Chemical Engineering，Huaiyin Institute of Technology，Huaian，Jiangsu223001，China；2.College of Food Science and Light Industry，Nanjing University of Technology，Nanjing，Jiangsu210009，China）

Ultrasonic－assisted complex enzymatic method was used to optimize the extraction conditions of polysaccharides fromphellinus linteus.Using the extraction yield of total polysaccharides as target，the process was optimized by investigating the influence of ultrasonic time，complex enzyme dosage，enzymolysis time，enzymolysis temperature and pH value.Results：Results showed that the optimal extraction conditions for polysaccharides fromphellinus linteusby ultrasonic－assisted complex enzymatic method were：ultrasonic time 300s，2.0%caroid，2.0%pectinase plus 2.0%cellulase，extraction temperature 50℃，extraction time 90min and pH 4.0，and in this condition，the polysaccharide yield could reach 1.46%.

ultrasound； complex enzymatic method；phellinus linteus；polysaccharides；single factor experiment

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.04.015

淮陰工學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：312409004）

尹秀蓮（1978－），女，淮陰工學(xué)院講師，在讀博士。E－mial：yinxiulian＠163.com

2011－04－20