張安民,張瑞萍,賈慧娟,王鵬程
(1.煙臺(tái)大學(xué) 體育學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264005;2.山西大學(xué) 體育學(xué)院,太原 030006)
不同游泳運(yùn)動(dòng)方式對大鼠海馬cAMP影響的實(shí)驗(yàn)研究
張安民1,張瑞萍1,賈慧娟2,王鵬程1
(1.煙臺(tái)大學(xué) 體育學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264005;2.山西大學(xué) 體育學(xué)院,太原 030006)
目的:觀察游泳運(yùn)動(dòng)后大鼠海馬cAMP濃度變化,探討不同游泳運(yùn)動(dòng)方式對海馬cAMP的影響機(jī)制。方法:建立大鼠游泳運(yùn)動(dòng)模型 (持續(xù)運(yùn)動(dòng)、間歇運(yùn)動(dòng)),采用酶聯(lián)接免疫吸附劑法,觀察大鼠海馬cAMP濃度變化,并用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果:運(yùn)動(dòng)后持續(xù)組和間歇組cAMP濃度均呈鋸齒形特征,但變化規(guī)律有明顯差異。持續(xù)組先降后升,與對照組相比在即刻、60min、120min、240min有所下降,有顯著差異 (p<0.05);在60min達(dá)到最低值 (p<0.01);運(yùn)動(dòng)后30min略高于對照組,無顯著差異性 (p>0.05)。間歇組先升后降且變化幅度逐漸增大,與對照組相比運(yùn)動(dòng)后240min cAMP濃度達(dá)到峰值,有顯著性差異 (p<0.01);而運(yùn)動(dòng)后30min、120min cAMP濃度呈下降趨勢,有顯著性差異 (p<0.01);運(yùn)動(dòng)后即刻、60min cAMP濃度略有上升,無顯著差異 (p>0.05)。結(jié)論:不同游泳運(yùn)動(dòng)方式對海馬cAMP的影響不同,具有一定的時(shí)效性。
海馬;第二信使cAMP;持續(xù)游泳運(yùn)動(dòng);間歇游泳運(yùn)動(dòng)
運(yùn)動(dòng)能促進(jìn)人的認(rèn)知功能和個(gè)性發(fā)展,特別是學(xué)習(xí)記憶這種腦功能的高級(jí)形式[1]。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明,運(yùn)動(dòng)有助于動(dòng)物海馬等與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元的增殖、存活和分化,促進(jìn)長時(shí)程增強(qiáng)的誘導(dǎo),提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空間記憶和被動(dòng)逃避記憶能力[2-3]。cAMP是最早確定的細(xì)胞內(nèi)的第二信使,作為細(xì)胞功能的信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)參與學(xué)習(xí)記憶過程[4-5]。因此,研究海馬與cAMP的表達(dá)變化將會(huì)對海馬的學(xué)習(xí)記憶過程有重要意義。本實(shí)驗(yàn)旨在探討不同游泳運(yùn)動(dòng)方式對大鼠海馬cAMP表達(dá)的時(shí)間變化規(guī)律及其可能的影響機(jī)制。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SD成年雄性大鼠55只,鼠齡3個(gè)月,體重250-300g,由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)條件:分籠飼養(yǎng),每籠4只,自由飲食,自然晝夜節(jié)律光照,室溫20±5℃。相對濕度在40%至60%。將大鼠隨機(jī)分為對照組 (n=5只)、持續(xù)運(yùn)動(dòng)組 (n=25只)、間歇運(yùn)動(dòng)組(n=25只)。
采用游泳運(yùn)動(dòng)方式建立運(yùn)動(dòng)動(dòng)物模型。游泳條件:塑鋼玻璃游泳池,150cm×60cm×70cm,水深為大鼠身體長度的2倍,約60cm,水溫保持在33℃ 至36℃ 之間,每個(gè)游泳池隨機(jī)分配5只大鼠。正式訓(xùn)練前運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行3天適應(yīng)性游泳訓(xùn)練,三天的運(yùn)動(dòng)時(shí)間每天分別為15min、20 min、30min。隨后開始正式的游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練,每周訓(xùn)練6次,共訓(xùn)練6周。負(fù)重為體重5%,游泳6min,休息4 min,每天連續(xù)進(jìn)行10組。對照組不做任何運(yùn)動(dòng),常規(guī)飼養(yǎng),自由活動(dòng)。訓(xùn)練結(jié)束后吹干毛發(fā),返回鼠籠。
采用HD-2006B天平,對大鼠的體重進(jìn)行全程測量。開始運(yùn)動(dòng)前測量一次,然后每周一運(yùn)動(dòng)前對所有大鼠進(jìn)行體重測量、記錄,便于統(tǒng)計(jì)分析。
最后一次游泳后,持續(xù)組和間歇組大鼠按運(yùn)動(dòng)后即刻、30min、60min、120min、240min五個(gè)時(shí)刻分別依次取材,操作如下:大鼠腹腔2%戊巴比妥鈉麻醉 (40mg/kg),斷頭,冰上取腦,置于-80℃液氮冷藏。對照組操作同上。
從液氮取出大鼠腦組織,復(fù)溫至常溫。根據(jù)大鼠立體定向圖譜,分離腦組織切取大鼠海馬組織約50mg—100mg,置于離心管,按10mg∶200ul比例加入0.01MPBS液,用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)將其制成乳白色懸液,12000r/min離心10分鐘,取上清液放入-4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
cAMP濃度的測定均采用雙抗體酶聯(lián)免疫吸附法 (Enzymes linked immunosorbant assays,ELISA法),大鼠環(huán)磷腺苷cAMP ELISA試劑盒購自美國R·B公司,均嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。檢測儀器采用Benchmark酶標(biāo)儀 (BIORAD公司)。
具體操作步驟:①加樣:將100ul標(biāo)準(zhǔn)品、100ul標(biāo)本加入相應(yīng)反應(yīng)板孔中;②輕輕混勻30s,封住板孔,37℃溫育90min;③洗板:甩盡板內(nèi)液體,用洗滌液洗滌反應(yīng)板 (每孔內(nèi)加入350ul洗滌液),并去除水滴 (在厚疊吸水紙上拍干);反復(fù)洗滌5次;④每孔加入100ul 1×Biotin。輕輕混勻30s,封住板孔,37℃溫育60min;⑤洗板:甩盡板內(nèi)液體,用洗滌液洗滌反應(yīng)板 (每孔內(nèi)加入350ul洗滌液),并去除水滴 (在厚疊吸水紙上拍干);反復(fù)洗滌5次;⑥每孔加入100ul 1×HRP。輕輕混勻30s,封住板孔,37℃溫育30min;⑦洗板:甩盡板內(nèi)液體,用洗滌液洗滌反應(yīng)板 (每孔內(nèi)加入350ul洗滌液),并去除水滴 (在厚疊吸水紙上拍干);反復(fù)洗滌5次;⑧每孔加入50ul顯色劑A和50ul顯色液B,輕輕混勻10s,37℃暗處溫育15±10min;⑨每孔加入100ul終止液 (Stop Solu-tion)。輕輕混勻30s;30min內(nèi)在450nm處讀OD值;⑩以O(shè)D值為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。并根據(jù)樣本的OD值查出其濃度,或用回歸方程計(jì)算其濃度。
采用SPSS12.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±s標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用t檢驗(yàn),p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
從表1可以看出,不同游泳運(yùn)動(dòng)方式對大鼠體重影響非常明顯。訓(xùn)練前三組大鼠 (對照組、持續(xù)組、間歇組)體重相比無顯著差異 (P>0.05);訓(xùn)練后對照組大鼠體重增加較快;持續(xù)組大鼠體重在第2周明顯下降,隨后保持穩(wěn)定;間歇組大鼠體重略有增長,但組間無顯著性差異。間歇組、持續(xù)組大鼠體重均低于對照組,且具有非常顯著性差異 (P<0.01)。說明兩種游泳訓(xùn)練都有一定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度,對大鼠的控體重有一定的影響。
表1 游泳訓(xùn)練后大鼠體重影響結(jié)果
2.2.1 持續(xù)游泳運(yùn)動(dòng)對大鼠海馬cAMP濃度的影響
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果顯示 (表2):持續(xù)游泳運(yùn)動(dòng)后cAMP濃度先降后升,與對照組相比在即刻、60min、120min、240min有所下降,有顯著差異 (p<0.05);在60min達(dá)到最低值,有非常顯著性差異 (p<0.01);運(yùn)動(dòng)后30min略高于對照組,無顯著差異性 (p>0.05)。
表2 大鼠海馬在五個(gè)不同時(shí)刻cAMP濃度變化 (持續(xù)游泳)
從圖1來看,運(yùn)動(dòng)后海馬cAMP濃度隨時(shí)間呈鋸齒形的變化,30min組上升幅度較大,隨后快速下降,120min、240min變化幅度逐漸趨于平緩。
2.2.2 間歇游泳運(yùn)動(dòng)對大鼠海馬cAMP濃度的影響
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果顯示 (表3):間歇游泳運(yùn)動(dòng)后cAMP濃度先升后降且變化幅度逐漸增大,與對照組相比運(yùn)動(dòng)后240min cAMP濃度達(dá)到峰值,有顯著性差異 (p<0.01);而運(yùn)動(dòng)后30min、120min cAMP濃度呈下降趨勢,有顯著性差異 (p<0.01);運(yùn)動(dòng)后即刻、60min cAMP濃度略有上升,無顯著差異 (p>0.05)。
表3 大鼠海馬在五個(gè)不同時(shí)刻cAMP濃度變化 (間歇游泳)
從圖2來看,運(yùn)動(dòng)后,海馬cAMP濃度隨時(shí)間呈鋸齒形的變化,即刻、60min組變化幅度較小,隨后變化幅度逐漸增大,240min cAMP濃度突然升高,達(dá)到峰值。
圖1 持續(xù)游泳運(yùn)動(dòng)對大鼠海馬cAMP在不同時(shí)刻表達(dá)的時(shí)效性
圖2 間歇游泳運(yùn)動(dòng)對大鼠海馬cAMP在不同時(shí)刻表達(dá)的時(shí)效性
經(jīng)過6周的游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練:持續(xù)運(yùn)動(dòng)組大鼠體重略有下降但基本保持穩(wěn)定;間歇運(yùn)動(dòng)組大鼠體重增加相對緩慢,皮毛光亮,體形勻稱。對照組大鼠體重增加較快,顯得臃腫。說明兩種游泳訓(xùn)練都有一定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度,對大鼠的控體重可能有一定的影響,證明游泳運(yùn)動(dòng)模型的建立較成功。
cAMP是細(xì)胞內(nèi)第二信使,參與學(xué)習(xí)和記憶過程[4-5]。在生理狀態(tài)下,神經(jīng)細(xì)胞中cAMP由三磷酸腺苷 (ATP)經(jīng)腺苷環(huán)化酶 (AC)催化生成,由磷酸二酯酶 (PDE)降解,二者的功能狀態(tài)維持神經(jīng)細(xì)胞cAMP水平穩(wěn)定。第二信使的特點(diǎn)是在短時(shí)間內(nèi)即可迅速產(chǎn)生,短時(shí)間內(nèi)又可迅速滅活,從而具有信號(hào)傳遞的功能。也就是說,在外來信號(hào)的作用下,第二信使上游的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白被激活后,利用特殊的原料,在短時(shí)間內(nèi)催化生成大量的第二信使,實(shí)現(xiàn)從胞外信號(hào)到胞內(nèi)的轉(zhuǎn)換和放大,同時(shí)在特定機(jī)制作用下,生成的大量第二信使被迅速降解或轉(zhuǎn)移,使細(xì)胞內(nèi)第二信使的濃度迅速降低,以保證信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一過性。
運(yùn)動(dòng)作為典型的應(yīng)激源,對cAMP濃度具有顯著性影響。羅艷蕊等[6]研究表明8周游泳訓(xùn)練導(dǎo)致心臟代償性肥大,cAMP/cGMP比值減小。黃元汛、張鈞[7]研究發(fā)現(xiàn),力竭運(yùn)動(dòng)使大鼠心肌中cAMP和cGMP均明顯高于對照組,說明力竭運(yùn)動(dòng)可造成心肌中cAMP和cGMP含量明顯升高。張安民[8-10]等研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)游泳訓(xùn)練和間歇性負(fù)重游泳訓(xùn)練能夠引起紋狀體cAMP濃度升高并產(chǎn)生后續(xù)時(shí)程變化,并且認(rèn)為這種變化可能與c-fos原癌基因、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子等有關(guān)。Zimmer[11]對實(shí)驗(yàn)性壓力超負(fù)荷動(dòng)物模型的研究發(fā)現(xiàn),壓力超負(fù)荷與心肌cAMP和心肌肥厚顯著正相關(guān);壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)了心肌cAMP濃度上升,同時(shí)cGMP濃度下降,cAMP/cGMP比值增大,推測環(huán)核苷酸系統(tǒng) (cAMP/cGMP)可能介導(dǎo)了壓力超負(fù)荷導(dǎo)致心肌肥大的反應(yīng)。同時(shí)心肌組織cAMP含量于術(shù)后0.5h明顯增加,術(shù)后5d時(shí)達(dá)峰值,術(shù)后30d降至正常。李衛(wèi)平等[12]實(shí)驗(yàn)表明:服用抗氧化劑對耐力運(yùn)動(dòng)組和間歇運(yùn)動(dòng)組恢復(fù)期的心肌cAMP濃度具有一定的影響,而對這兩組恢復(fù)期的心肌cGMP濃度則并無顯著性作用;運(yùn)動(dòng)方式和抗氧化劑是影響心肌cAMP、cGMP濃度變化的主要因素。徐松德等[13]將34只家兔隨機(jī)分為對照、運(yùn)動(dòng)和不運(yùn)動(dòng)三組,后兩組每只家兔喂膽固醇200mg/d,試驗(yàn)四周后結(jié)果表明運(yùn)動(dòng)組動(dòng)脈壁cAMP水平增加19.2%,不運(yùn)動(dòng)組則降低49.4%;肝臟cAMP含量運(yùn)動(dòng)組與不運(yùn)動(dòng)組分別降低21.2%和15.7%,血漿cAMP濃度運(yùn)動(dòng)組與不運(yùn)動(dòng)組分別升高0.95%和6.8%。王澤軍等[14]研究表明游泳訓(xùn)練可以使大鼠海馬cAMP濃度分別發(fā)生了顯著的升高。Bernabeu[15]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)大鼠海馬cGMP水平在訓(xùn)練后即刻達(dá)峰值,相反cAMP水平在3h后才達(dá)峰值。
本實(shí)驗(yàn)把間歇運(yùn)動(dòng)和持續(xù)運(yùn)動(dòng)作為應(yīng)激源對大鼠進(jìn)行研究,該二者是兩種完全不同的運(yùn)動(dòng):前者是一種極限強(qiáng)度并且嚴(yán)格控制運(yùn)動(dòng)和間歇時(shí)間的無氧訓(xùn)練方法[16],后者具有強(qiáng)度低、有節(jié)奏、持續(xù)時(shí)間較長的特點(diǎn)。通過六周的游泳訓(xùn)練,結(jié)果顯示,不同游泳運(yùn)動(dòng)對大鼠海馬cAMP影響不同。二者雖然都呈鋸齒形特征,但變化規(guī)律相差甚遠(yuǎn)。間歇運(yùn)動(dòng)組先升后降且幅度逐漸增大,運(yùn)動(dòng)后即刻與對照組相比略有上升,但無顯著差異 (p>0.05),運(yùn)動(dòng)后30min cAMP濃度呈下降趨勢,有顯著性差異 (p<0.01);60min cAMP濃度略有上升,無顯著差異 (p>0.05),運(yùn)動(dòng)后120min cAMP濃度呈下降趨勢,有顯著性差異 (p<0.01);運(yùn)動(dòng)后240min cAMP濃度達(dá)到峰值,有顯著性差異 (p<0.01)。原因可能是由于長期的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練刺激,使cAMP一PKA通路中的某些激素受體的適應(yīng)能力增強(qiáng)所致。在cAMP/PKACREB信號(hào)通路中,活化的PKA催化亞基可以通過細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)位而接近底物蛋白CREB,使CREB磷酸化,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性[17],從而介導(dǎo)細(xì)胞對外界刺激 (如運(yùn)動(dòng))的反應(yīng)。而CREB作為核內(nèi) “第三信使”,被認(rèn)為是對外部刺激產(chǎn)生適應(yīng)以及長時(shí)記憶的最適合轉(zhuǎn)錄因子。磷酸化的CREB可以激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,其中包括調(diào)節(jié)C-FOS以及通過Ca2+依賴性的形式調(diào)節(jié) BDNF的表達(dá)[18-19]。間歇組cAMP濃度在240min達(dá)到峰值說明在這一時(shí)刻可能海馬的學(xué)習(xí)記憶能力得到了很大的提高。持續(xù)運(yùn)動(dòng)組先降后升,與對照組相比在即刻有所下降,有顯著差異 (p<0.05);運(yùn)動(dòng)后30 min略高于對照組,但無顯著差異性 (p>0.05);在60min達(dá)到最低值 (p<0.01);120min有所上升但仍低于對照組,240min略有下降,二者均有顯著差異 (p<0.05)。持續(xù)組cAMP濃度只有在運(yùn)動(dòng)后30min略高于對照組且無明顯差異,其他時(shí)刻均低于對照組。其變化比較平緩可能和對運(yùn)動(dòng)的適應(yīng)、cAMP的一過性等特點(diǎn)有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)cRE BmRNA升高是在運(yùn)動(dòng)結(jié)束后第3d以及第7d,在第28d cREBmRNA水平并無顯著變化[20]??傊?,不同運(yùn)動(dòng)方式(運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)間歇等)對海馬cAMP濃度變化存在一定的時(shí)效性 (表達(dá)峰值、表達(dá)持續(xù)時(shí)間等)。
海馬cAMP濃度的變化和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)量有很大的關(guān)系[21]。疾病、運(yùn)動(dòng)、藥物等多種刺激因素均可引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度發(fā)生改變繼而引發(fā)后續(xù)各種反應(yīng)[22-32]。研究不同運(yùn)動(dòng)方式對大鼠海馬cAMP濃度的影響,把體育鍛煉作為一種積極而有效的方法,可以為在學(xué)習(xí)記憶或腦功能方面有缺陷的患者提供一定的幫助,同時(shí)可以為制定運(yùn)動(dòng)處方提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程極為復(fù)雜,多是通過多條信息轉(zhuǎn)導(dǎo)的分支與匯聚來實(shí)現(xiàn)的。cAMP的變化又是如何影響PKA、CREB等相關(guān)蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子的,這些問題的提出與解決,有助于我們今后更深入的研究。究竟何種方式、強(qiáng)度及持續(xù)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)對學(xué)習(xí)記憶的提高最適宜?這將是繼續(xù)研究的關(guān)鍵問題。
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The Experimental Study on the Effect of Different Swimming Ways on the Rat Hippocampus’s cAMP
ZHANG An-min1,ZHANG Rui-ping1,JIA Hui-juan2,WANG Peng-cheng1
(1.College of Physical Education,Yantai University,Yantai 264005,China;2.College of Physical Education,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)
Objective:To observe the change of cAMP concentration in rat hippocampus after swimming and to explore different swimming ways’effect on the hippocampal cAMP.Methods:To establish a rat swimming model(continued swimming,intermittent swimming),using enzyme link immunosorbent method to observe the changes of hippocampal cAMP concentration,and use statistical software for data analysis.Results:After exercise the continued group and the intermittent group’s cAMP concentration all appeared the shape of sawteeth,but there are significant differences in variation.Continued group falls first and then rises,compared with the control group,it declines in the immediate,60min,120min,240min,there are significant differences(p<0.05);in 60min it reaches the minimum (p<0.01);slightly higher than the control group 30min after exercise,there was no significant difference(p>0.05).The intermittent group increases first and then decreases gradually and the magnitude changes,as compared with the control group,the cAMP concentration reaches its peak 240min after exercise,there is a significant difference(P<0.01);and 30min,120min after exercise,cAMP concentration is in a downward trend,there was a significant difference(P<0.01);The cAMP concentration increases slightly immediately after exercise,60min,there is no significant difference(p>0.05).Conclusion:Different ways of swimming have different impact on hippocampal cAMP and it has a certain timeliness.
hippocampus;second messenger cAMP;endurance swimming;intermittent swimming
G804.7
A
1008-3596(2011)06-0078-05
2011-08-10
國家自然科學(xué)
(30671019);山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y2008c29)
張安民 (1959-),男,山西萬榮人,教授,研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)。