王志毅，馬英姿，王曉明，宋 榮 ，張 慧

(1.中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004; 2. 湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙 410004)

凹葉厚樸離體胚培養(yǎng)的研究

王志毅1，馬英姿1，王曉明2，宋 榮1，張 慧1

(1.中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004; 2. 湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙 410004)

為了滿足市場的資源需求，建立優(yōu)質(zhì)凹葉厚樸離體再生體系，為凹葉厚樸工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，以優(yōu)質(zhì)凹葉厚樸離體胚為外植體，以B5為基本培養(yǎng)基，6-BA、NAA、消毒時(shí)間為因素，采用L9(33) 正交設(shè)計(jì)，進(jìn)行無菌苗培養(yǎng)優(yōu)化試驗(yàn)。結(jié)果表明：最佳消毒方法為0.1%升汞浸泡8 min，污染率為12.6%，外植體生長良好；最佳組合為B5+ 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L + 消毒時(shí)間8 min，發(fā)芽率高達(dá)87%。

凹葉厚樸；正交設(shè)計(jì)；再生體系；發(fā)芽率

凹葉厚樸Magnolia off i cinalissubsp.biloba，為厚樸Magnolia off i cinalis的亞種，是中國特有的木蘭科木蘭屬植物。在中藥生產(chǎn)中，厚樸及凹葉厚樸都統(tǒng)稱為厚樸，是中國傳統(tǒng)的大宗中藥材，其根皮以及枝皮都可入藥，具有燥濕消痰等功效，用于食積氣滯，腹脹便秘，痰飲喘咳[1]。厚樸酚（Magnolol）與和厚樸酚（Honokiol）是主要活性成分，具有多種藥理作用，包括抗炎，抗心律失常，抗癲癇，抗血小板，抑制肌肉收縮和抗菌等。由于資源保護(hù)不利，野生厚樸（凹葉厚樸）已瀕臨枯竭，在20世紀(jì)80年代，已被國家定為Ⅱ級(jí)保護(hù)植物和Ⅱ級(jí)保護(hù)野生中藥材。由于資源的不斷減少，大批生長年限不足的厚樸（凹葉厚樸）被提前砍伐，造成藥材整體質(zhì)量下降，《中華人民共和國藥典》對(duì)厚樸（凹葉厚樸）有效成分厚樸總酚的含量規(guī)定也由3%降到了2%，這種情況在國家標(biāo)準(zhǔn)制訂的歷史中是罕見的[2]。湖南永州產(chǎn)凹葉厚樸有效成分含量高，植株優(yōu)良。利用生物技術(shù)方法對(duì)優(yōu)質(zhì)凹葉厚樸進(jìn)行快速繁殖研究、實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)是解決資源不足的有效途徑[3-4]。本研究對(duì)凹葉厚樸離體胚進(jìn)行培養(yǎng)，獲取最佳培養(yǎng)方法，為進(jìn)一步規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)[5-7]。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料來自湖南永州產(chǎn)優(yōu)質(zhì)凹葉厚樸，采其種子作為外植體。

1.2 方 法

1.2.1 外植體處理

用解剖刀夾破種殼，取出胚囊，然后依次用75%酒精進(jìn)行表面消毒15～30 s、無菌水漂洗3～4次、0. 1% 氯化汞消毒6～10 min、無菌水再次漂洗5～6次，最后用無菌濾紙或紗布吸干、備用[8-9]。

1.2.2 不同種類及質(zhì)量濃度的激素選擇

通過單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)，得出B5培養(yǎng)基最適合外植體生長，細(xì)胞分裂素6-BA，KT和細(xì)胞生長素NAA，?BA對(duì)外植體的生長起到促進(jìn)作用。因此在相同基本培養(yǎng)基上分別添加兩種激素進(jìn)行雙因素試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)每組的發(fā)芽率和污染率，從而選擇適合的激素種類和質(zhì)量濃度組合。

1.2.3 最佳配比方案選擇

在對(duì)適合的細(xì)胞分裂素和生長素及質(zhì)量濃度選擇后，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，分別以細(xì)胞分裂素，細(xì)胞生長素和消毒時(shí)間為3因素，不同質(zhì)量濃度和時(shí)間分別設(shè)計(jì)3個(gè)水平，同時(shí)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，LSD法對(duì)各因素各個(gè)水平之間進(jìn)行多重比較[10-11]，確定最佳配比方案。

1.3 培養(yǎng)基制作

制備B5固體培養(yǎng)基，調(diào)pH 值為5. 8～6. 0，用廣口瓶分裝，置于LDZX-40Ⅱ型自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋，于1. 06 kg/cm2的壓力下121 ℃消毒2 h[12]。

1.4 培養(yǎng)方法及條件

采用B5固體培養(yǎng)基：瓊脂6. 5～7.0 g/L，蔗糖25 g/L，pH值5. 8～6.0，于( 25±1)℃、暗培養(yǎng)8～10 d 后，再進(jìn)行光照培養(yǎng)（2 000 lx），15 d 后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類及質(zhì)量濃度的激素對(duì)離體胚培養(yǎng)的影響

將消毒處理后的凹葉厚樸離體胚在B5固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)添加不同種類及質(zhì)量濃度的細(xì)胞分裂素和生長素，定期觀察離體胚的生長情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率和污染率[14]，試驗(yàn)結(jié)果見表1～3。

通過表1和表2可知，當(dāng)保持生長素NAA 質(zhì)量濃度一致，改變分裂素6-BA 的質(zhì)量濃度時(shí)，平均發(fā)芽率為51.25%，最高發(fā)芽率為68%；而用分裂素KT時(shí)，平均發(fā)芽率為45.75%，最高發(fā)芽率僅為62%，并且各質(zhì)量濃度的6-BA對(duì)芽的誘導(dǎo)率都要高于相應(yīng)質(zhì)量濃度KT，這足以說明6-BA 對(duì)發(fā)芽率的影響要比KT的更為顯著。

比較分析表1 和表3，當(dāng)每組分裂素6-BA 的質(zhì)量濃度保持一致時(shí)，取相同質(zhì)量濃度的生長素NAA、?BA 作對(duì)比試驗(yàn)：結(jié)果表明NAA 對(duì)發(fā)芽率的誘導(dǎo)效果好于?BA。因此，選用分裂素6-BA 和生長素NAA 作為進(jìn)一步培養(yǎng)的激素種類。

表1 6-BA 與NAA 的組合Table 1 Combination of 6-BA and NAA

表2 KT 與NAA 組合Table 2 Combination of KT and NAA

表3 6-BA 與?BA 組合Table 3 Combination of 6-BA and IBA

2.2 最佳培養(yǎng)方案的確定

確定分裂素和生長素種類后，選擇因素A ：6-BA (0.5、1.0、0.1 mg·L-1) ， 因 素 B ：NAA(0.05、0.1、0.2 mg·L-1) ，因素 С ：消毒時(shí)間(6、8、10 min) ，3因素3 水平，選用 L9(33) 正交表做正交試驗(yàn)(見表4)，同時(shí)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，LSD法對(duì)各因素各個(gè)水平之間進(jìn)行多重比較[15](見表5)。

通過表4 的數(shù)據(jù)分析，可以得出各因素內(nèi)各個(gè)水平之間的極差(R)。極差的大小反映了該因素的影響程度，極差大的因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響也大。從R的大小可知，對(duì)發(fā)芽率影響因素的大小依次是：6-BA＞ NAA＞消毒時(shí)間。從表4 還可得出各因素的最優(yōu)水平組合即6-BA：0.5 mg/L，NAA：0.1 mg/L，消毒時(shí)間：8 min，該組合方式對(duì)凹葉厚樸離體胚培養(yǎng)的發(fā)芽率可高達(dá)87% 。

表5則顯示出方差分析結(jié)果： 因素A (6-BA)和因素B (NAA) 對(duì)胚發(fā)芽率影響顯著(P≤0.05)。經(jīng)LSD 多重分析比較得出：因素A (6-BA) 的各個(gè)水平之間存在顯著差異(P＜ 0.05)；因素B (NAA)的水平1、2（0.05、0.1 mg·L-1) 之間無顯著差異（P＞ 0. 05），水平 2、3（0.1、0.2 mg·L-1) 之間和 1、3（0.05、0.2 mg·L-1) 之間均存在顯著差異 (P＜0.05)；因素С（消毒時(shí)間）各個(gè)水平之間也無顯著差異 (P＞ 0. 05)。

表4 L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of L9(33) orthogonal test

表5 L9(33)正交試驗(yàn)的方差分析Table 5 Variance analsis of L9(33) orthogonal tests

綜上分析，在凹葉厚樸離體胚培養(yǎng)的過程中，分裂素6-BA選用0.5 mg/L，生長素NAA選用0.05或0.1 mg/L ，消毒時(shí)間 ( 6、8、10 min) 對(duì)結(jié)果的影響差異不顯著。從正交試驗(yàn)的方差分析可知：生長素NAA在0.05～0.1 mg/L都適合離體胚的生長，但從無菌苗的生長勢來看，NAA 為0.1 mg/L時(shí)生長勢較好(圖1、圖2)，因而激素NAA濃度選用0.1 mg/L。

圖1 NAA 0.05 mg/L,25 d后的生長情況Fig. 1 Growth condition of M. officinalis with NAA 0.05 mg/L,after 25 days

圖2 NAA 0.1mg/L,25d后的生長情況Fig. 2 Growth condition of M. officinalis with NAA 0.1 mg/L, after 25 days

3 小 結(jié)

本研究對(duì)適合凹葉厚樸離體胚生長的激素種類及濃度分別進(jìn)行了雙因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，從中篩選凹葉厚樸離體胚最適培養(yǎng)基。由正交試驗(yàn)和方差分析結(jié)果可知，6-BA、NAA、消毒時(shí)間3因素的最佳水平組合為B5+ 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L+ 消毒時(shí)間8 min，發(fā)芽率高達(dá)87%。該結(jié)果也為今后凹葉厚樸優(yōu)質(zhì)資源再生體系構(gòu)建以及次生代謝研究等方面奠定了良好的基礎(chǔ)[16-17]。

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In vitro embryonic culture of Magnolia off i cinalis subsp. biloba

WANG Zhi-yi1, MA Ying-zi1, WANG Xiao-ming2, SONG Rong1, ZHANG Hui1
(1. School of Life Science and Technology, Сentral South University of Forestry & Technology, Сhangsha 410004,Hunan,Сhina;2. Hunan Academy of Forestry, Сhangsha 410004, Hunan,Сhina)

?n order to satisfy the market’s demands for the resources ofMagnolia officinalissubsp.biloba (Rehd.et Wils.)Law., set up a high quality rapid propagation regeneration system ofM. officinalis, and provide a theoretical basis for factory production，the optimization tests of aseptic seedling culture onM. off i cinalishave been carried out by using its embryos as in vitro culture material,adopting orthogonal design L9(34) method, and setting up 6-BA, NAA and disinfected time as the three main factors (every factor having 3 levels) . The results indicate that the best disinfect method was to sterilize the explants by mecruric chloridein （0.l%）for 8 minutes,and the optimum combination was B5+ 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L+ 8 minutes (disinfection time), its germination rate reached 87%.

Magnolia off i cinalissubsp.biloba; orthogonal design; regeneration system ; germination rate

S727.34

A

1673-023X (2012)05-0050-04

2011-12-06

國家行業(yè)科研專項(xiàng)(201104023) ；湖南省研究生教改項(xiàng)目(JG2011B027)；湖南省科技廳項(xiàng)目(2011NK3042)

王志毅(1985-)，女，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，研究方向?yàn)橘Y源植物的開發(fā)與利用；E-mail: hnxxwzy@163.com

馬英姿(1967-)，女，河南鞏義人，副教授，博士，研究方向?yàn)橘Y源植物的開發(fā)與利用；E-mail: ma_yingzi@163.com

[本文編校：吳 毅]