鄭斯竹 ，安榆林 ，徐 梅 ，楊曉軍 ，常 虹 ，嵇保中

（1. 南京林業(yè)大學(xué) 森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037；2. 江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局植物檢疫實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210001）

天牛幼蟲(chóng)保存與DNA提取方法比較研究

鄭斯竹1，安榆林2，徐 梅2，楊曉軍2，常 虹1，嵇保中1

（1. 南京林業(yè)大學(xué) 森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037；2. 江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局植物檢疫實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210001）

為了開(kāi)展天?？评ハx(chóng)分子系統(tǒng)學(xué)研究，采用酚-氯仿提取法、TakaraDNA快速提取試劑盒及GenMagBio動(dòng)物細(xì)胞組織/細(xì)胞基因組DNA磁珠提取試劑盒3種方法分別對(duì)75%乙醇常溫保存、無(wú)水乙醇-20℃冷藏保存和活體4℃保存3種保存方式且保存時(shí)間1年以上的松墨天牛幼蟲(chóng)進(jìn)行DNA提取，并對(duì)不同提取方法所獲取的DNA純度與質(zhì)量進(jìn)行分析比較，確定了長(zhǎng)時(shí)間保存天牛幼蟲(chóng)以無(wú)水乙醇浸漬-20℃冷藏保存效果最佳，而用GenMagBio磁珠法提取試劑盒提取DNA出現(xiàn)降解的標(biāo)本提取效果最好。應(yīng)用GenMagBio磁珠提取試劑盒對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存多年的天牛幼蟲(chóng)標(biāo)本進(jìn)行DNA提取，并對(duì)提取DNA是否適合后續(xù)的PСR擴(kuò)增及DNA序列測(cè)定進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果符合預(yù)期。

松墨天牛; 天牛幼蟲(chóng)；保存方式；DNA提??；磁珠法

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)在昆蟲(chóng)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，基因條碼技術(shù)的興起以及外來(lái)生物基因庫(kù)的逐步建立，使因昆蟲(chóng)卵、幼蟲(chóng)等階段特征差異小，有些鑒定特征在不同的發(fā)育時(shí)期不夠穩(wěn)定等因素引起的形態(tài)鑒定困難有了新的解決途徑。如何從昆蟲(chóng)樣品中獲得有效的DNA模板是分子鑒定成功的前提，DNA提取質(zhì)量的優(yōu)劣，也直接關(guān)系到下游實(shí)驗(yàn)的安全與成敗。昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)標(biāo)本由于缺乏堅(jiān)硬體壁的保護(hù)，所以采集后的處理方式、后期儲(chǔ)存條件等因素對(duì)其DNA質(zhì)量影響大，一旦保存不當(dāng)其基因組DNA降解會(huì)非常嚴(yán)重，還會(huì)產(chǎn)生許多PСR實(shí)驗(yàn)抑制因子。而許多實(shí)驗(yàn)室因?yàn)橐郧皼](méi)有考慮到要開(kāi)展分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，對(duì)所擁有的標(biāo)本簡(jiǎn)單地采用75%酒精常溫保存，使得許多珍稀幼蟲(chóng)標(biāo)本用傳統(tǒng)方法進(jìn)行DNA提取時(shí)，提取結(jié)果無(wú)法滿足實(shí)驗(yàn)需要，使后續(xù)實(shí)驗(yàn)難以進(jìn)行。采用傳統(tǒng)的酚-氯仿法提取DNA，操作復(fù)雜而耗時(shí)，DNA回收率低，無(wú)法充分去除對(duì)PСR實(shí)驗(yàn)的抑制因子，且對(duì)人體帶有潛在的危險(xiǎn)性。目前常用的TakaraDNA快速提取試劑盒可應(yīng)用于1～100 mg動(dòng)物組織DNA的快速提取，全程只需要2.5 h，高效快速，但其過(guò)程中所使用的異丙醇、異丁醇等試劑同樣具有污染性，且對(duì)樣品質(zhì)量要求較高?；诖胖榉ǖ腄NA提取方法是近年興起的一種新技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)[1]、醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)[2]等領(lǐng)域，該方法以納米磁珠為DNA載體，將分離技術(shù)和富集技術(shù)有機(jī)地結(jié)合為一體，通過(guò)簡(jiǎn)單的洗脫即可以得到高純度DNA。筆者嘗試使用磁珠DNA提取法提取不同保存條件下的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)DNA，并與上述2種常用提取方法進(jìn)行比較，對(duì)所獲得的DNA進(jìn)行了質(zhì)量和純度等方面的檢測(cè)分析，以期獲得分子檢測(cè)所需要的最佳幼蟲(chóng)標(biāo)本保存方法和DNA提取方法。

1 材料和方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)及處理方式

本研究實(shí)驗(yàn)標(biāo)本松墨天牛Monochamus alternatus幼蟲(chóng)于2010年4月采集于南京紫金山，分別以75%乙醇常溫、無(wú)水乙醇-20°С冷藏和活體4°С保存3種方式保存。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本墨天牛M.spp.幼蟲(chóng)（2010.03）為100%乙醇常溫固定保存；云杉大墨天牛M. urussovi幼蟲(chóng)（2006.08）、落葉松斷眼天牛Tetropium gabrieli幼蟲(chóng)（2009.06）、褐梗天牛Arhopalus rusticus幼蟲(chóng)（2009.05）3種為75%乙醇常溫固定保存。

1.2 DNA提取

3種保存方法保存的天牛幼蟲(chóng)標(biāo)本，每種樣品取3份，采用酚氯仿法、Takara快速提取試劑盒、GenMagBio磁珠提取試劑盒3種方法進(jìn)行DNA提取。

酚-氯仿法[3]：剪取松墨天牛幼蟲(chóng)蟲(chóng)體腹部一段，去除消化道、脂肪、體壁，保留肌肉約19 mg于MM400球磨儀中震蕩研磨（30次/s）20～30 s，后加入1 mL提取液（10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，1 mmol/L乙二胺四乙酸，1%十二烷基硫酸鈉），使蛋白酶K終濃度達(dá)到10 μg/mL，55℃水浴3～5 h。水浴結(jié)束后，苯酚/氯仿/異戊醇（v/v, 25:24:1）抽提2次，氯仿抽提至無(wú)沉淀產(chǎn)生。2倍體積無(wú)水乙醇-20℃過(guò)夜沉淀DNA，12 000 r/ min離心 10 min；棄上清，70% 乙醇清洗沉淀 2 次，干燥后溶解于50 μL TE中。

TaKaRa DNA 快速提取試劑盒提取DNA[4]：剪取松墨天牛幼蟲(chóng)蟲(chóng)體腹部一段，去除消化道、脂肪、體壁，保留肌肉約19 mg于MM400球磨儀中震蕩研磨（30次/s）20～30 s，12 000 r/ min離心 10 min。后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用TaKaRa DNA 提取試劑盒提取DNA，操作方法根據(jù)其使用說(shuō)明書(shū)。

GenMagBio動(dòng)物細(xì)胞組織/細(xì)胞基因組DNA磁珠提取試劑盒：直接剪取松墨天牛幼蟲(chóng)蟲(chóng)體19 mg，保留脂肪、體壁、消化道不做任何處理，放于MM400球磨儀中震蕩研磨（30次/s）20 ～ 30 s， 加 入 180 μL Lysis Buffer、20 μL Proteinase K（55℃溫浴3～5 h，加入200 μL Binding Buffer和200 μL無(wú)水乙醇，充分混勻，加入20 μL磁珠，輕柔顛倒混勻10 min。離心管置于磁力架，吸棄管內(nèi)液體，保留磁珠，Wash Buffer ? （500 μL 顛倒混勻 2 min置于磁力架，棄去管內(nèi)液體，Wash Buffer Ⅱ同樣洗滌2次，離心管仍置于磁力架上，緩慢加入Wash Buffer Ⅲ，1 min后移走管內(nèi)液體。加入Elution Buffer，55℃水浴10 min洗脫磁珠上吸附的DNA。

1.3 DNA 純度及質(zhì)量濃度檢測(cè)方法

1μLDNA 稀釋 50 倍，在 EPPENDORF 公司生產(chǎn)的生物分光光度計(jì)（Biophotometer6131）下測(cè)定波長(zhǎng) 260、280 nm 的光吸收值(OD) 并自動(dòng)計(jì)算OD260/OD280的比值以及相應(yīng)的質(zhì)量濃度值。當(dāng)OD260/OD280的值低于1.6時(shí)，樣品中有蛋白質(zhì)或酚的污染；高于 1.9則說(shuō)明樣品中有 RNA污染。

1.4 DNA 凝膠電泳的檢測(cè)

單 輪 PСR 引 物：J1718，5′- GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTT СС -3′；N2191， 5′-ССС GGT AAA ATT AAA ATA TAA AСT TС -3′[5]。巢式PСR使用引物：第一輪，J173：5′-TAA СAG СAС ATG СTT TTG TA-3′；J1331：5′-GGA TAG TСT GAG TAT СGT СG-3′（自行設(shè)計(jì)）；第二輪，J1718和N2191。PСR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳分離，可得到528 bp 左右的擴(kuò)增片段。

1.5 目標(biāo)DNA擴(kuò)增及СO?序列測(cè)定

使用GenMagBio動(dòng)物細(xì)胞組織/細(xì)胞基因組DNA磁珠提取試劑盒對(duì)墨天牛屬、落葉松斷眼天牛、褐梗天牛及云杉大墨天牛4個(gè)75%酒精常溫保存的幼蟲(chóng)標(biāo)本進(jìn)行DNA提取、巢式PСR擴(kuò)增，根據(jù)電泳圖上此擴(kuò)增片段的有無(wú)判斷是否提取到目標(biāo)DNA。對(duì)目標(biāo)DNA純化測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)網(wǎng)上比對(duì)，查看是否為目標(biāo)片段，即線粒體СO?基因DNA的擴(kuò)增片段， 以對(duì)GenMagBio磁珠試劑盒效果進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 濃度與純度

從表1可看出，75%乙醇常溫保存標(biāo)本用3種方法提取出的DNA濃度和OD值都是最低的?；铙w標(biāo)本與無(wú)水乙醇-20°С保存的標(biāo)本使用酚-氯仿法和GenMagBio磁珠試劑盒法提取的DNAOD260/280值都處于1.7～1.9之間，屬于高質(zhì)量DNA，Takara快速提取試劑盒提取的DNAOD260/280值高于1.9，含RNA污染。從質(zhì)量濃度的角度看，活體4°С冰箱保存方法保存的標(biāo)本DNA質(zhì)量濃度最高，75%乙醇常溫保存標(biāo)本的質(zhì)量濃度最差，無(wú)水乙醇-20°С保存的標(biāo)本質(zhì)量濃度居中。而從3種提取方式看，同質(zhì)量樣品常規(guī)酚-氯仿法提取出的DNA量最大，Takara試劑盒最小，GenMagBio磁珠試劑盒居中。尤其是使用Takara試劑盒提取75%乙醇常溫保存的樣品，DNA的濃度與OD260/280值都無(wú)法測(cè)量，可能是標(biāo)本本身DNA降解嚴(yán)重且該方法使用過(guò)程中DNA損耗大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合文獻(xiàn)所述常規(guī)酚氯仿法最適于新鮮標(biāo)本的大量DNA提取，而現(xiàn)在一般實(shí)驗(yàn)室采用的無(wú)水乙醇-20°С保存標(biāo)本方式，DNA也同樣存在降解現(xiàn)象。活體保存雖然實(shí)驗(yàn)效果最好，但現(xiàn)在的保存技術(shù)還無(wú)法做到長(zhǎng)時(shí)間保存，筆者最長(zhǎng)保存松墨天牛幼蟲(chóng)時(shí)間為1～2 a。

表1 不同保存和提取方法樣品的DNA濃度與純度?Table 1 The purity and concentration of DNA samples obtained with different extraction and preservation methods

2.2 天牛DNA的電泳檢測(cè)

3種方法分別提取3種保存方式松墨天牛幼蟲(chóng)標(biāo)本DNA，對(duì)所得DNA СO?保守區(qū)域進(jìn)行PСR擴(kuò)增。擴(kuò)增片段大小為525 bp。擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。

從圖1可看出，用酚氯仿法與Takara試劑盒提取的活體保存松墨天牛DNA的PСR擴(kuò)增結(jié)果并不好，酚氯仿只擴(kuò)增出1條帶，Takara試劑盒法擴(kuò)增出2條帶且顏色暗淡，GenMag磁珠試劑盒法則3條帶全擴(kuò)出且亮。通過(guò)表1分析，可能是酚氯仿法提取出的DNA濃度過(guò)高不適合直接進(jìn)行PСR擴(kuò)增，應(yīng)按比例稀釋，而Takara試劑盒法濃度和OD值都在標(biāo)準(zhǔn)范圍，其原因需進(jìn)一步探討，GenMag磁珠試劑盒則擴(kuò)增效果穩(wěn)定。3種方法提取無(wú)水乙醇-20度冷藏保存標(biāo)本DNA的PСR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶基本全部跑出，條帶明顯，說(shuō)明該保存方法保存DNA可滿足進(jìn)一步分子實(shí)驗(yàn)。3種方法提取75%乙醇常溫保存樣品提取出的DNA都未能在單輪PСR條件下擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明DNA確實(shí)出現(xiàn)大量降解，導(dǎo)致目標(biāo)DNA片段多少，所以將1b～3b 9份DNA樣品進(jìn)行巢式PСR。

圖1 3種取方法天牛СO?基因單輪PСR結(jié)果電泳檢測(cè)圖譜Fig. 1 Single-PCR amplification results of COI obtained by three methods

圖2 75%乙醇常溫保存標(biāo)本巢式PСR結(jié)果電泳檢測(cè)圖譜Fig. 2 Net-PCR amplification results of COI preserved with 75% Alcohol

經(jīng)過(guò)巢式PСR擴(kuò)增后GenmagBio磁珠提取試劑盒提取的松墨天牛幼蟲(chóng)樣品擴(kuò)增出條帶，而其它2種方法提取出的DNA仍未擴(kuò)增出條帶（見(jiàn)圖2），說(shuō)明GenMagBio磁珠試劑盒因其只吸附DNA的特性，提取對(duì)DNA降解嚴(yán)重樣品提取效果最好，其OD值過(guò)低可能由于DNA大量斷裂成小分子片段引起。為進(jìn)一步證明此方法獲得的結(jié)果為實(shí)驗(yàn)所要，選取墨天牛屬、落葉松斷眼天牛、褐梗天牛、云杉大墨天牛實(shí)驗(yàn)室75%酒精常溫保存幼蟲(chóng)標(biāo)本進(jìn)行巢式PСR擴(kuò)增。從圖3可看出該方法能提取到目標(biāo)DNA。之后對(duì)目標(biāo)DNA的PСR產(chǎn)物進(jìn)行純化測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)GENBANK上比對(duì)，驗(yàn)證其為預(yù)期的線粒體СO?基因片段。

圖3 d、e、f、g 4個(gè)樣品巢式PСR結(jié)果電泳圖Fig. 3 Net-PCR amplification results of four samples (d, e ,f, g)

3 結(jié)論與討論

昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)標(biāo)本體壁柔軟，組織幼嫩，極易破碎分解，造成DNA降解。為防止保存標(biāo)本的DNA降解以便于日后的分子實(shí)驗(yàn)，目前實(shí)驗(yàn)室多采用無(wú)水乙醇-20°С的方法保存標(biāo)本[6]。本研究的實(shí)驗(yàn)表明，同樣保存時(shí)間下，相同體積活體保存樣品和無(wú)水乙醇-20°С保存樣品所提取的DNA量從1 248 μg/mL下降到了478 μg/mL，說(shuō)明無(wú)水乙醇-20°С保存樣品同樣存在較明顯的DNA降解。但活體低溫保存僅限于脂肪含量高、有較長(zhǎng)越冬期的部分天牛幼蟲(chóng)，且也無(wú)法長(zhǎng)期保存。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)活體直接-70°С冷凍保存后DNA降解嚴(yán)重，說(shuō)明單純的溫度降低對(duì)DNA影響遠(yuǎn)小于其體內(nèi)水分的影響。不過(guò)實(shí)驗(yàn)證明無(wú)水乙醇-20°С的方法保存的標(biāo)本完全可以滿足后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)需要。所以目前最適合普通實(shí)驗(yàn)室昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)保存的方法還是無(wú)水乙醇-20°С保存。不過(guò)為了更長(zhǎng)期地保存昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)標(biāo)本以滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的需要，還需要進(jìn)一步探索效果更好的幼蟲(chóng)標(biāo)本保存方法。

磁珠法提取DNA試劑盒是納米技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、生物醫(yī)學(xué)技術(shù)和法醫(yī)學(xué)技術(shù)的綜合高科技產(chǎn)品，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)等許多領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)證明磁珠DNA提取試劑盒在提取DNA已嚴(yán)重降解的天牛幼蟲(chóng)標(biāo)本時(shí)，效果遠(yuǎn)好于現(xiàn)在常用的酚氯仿法與TakaraDNA快速提取試劑盒，雖然在提取75%酒精常溫保存的松墨天牛幼蟲(chóng)時(shí)OD值偏低，只有1.53，但在PСR實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，其原因可能是由于DNA含量過(guò)少。而且GenMagBio磁珠提取試劑盒相比其它2種方法操作更為簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)移離心管的次數(shù)較少，不易污染，且不需要使用離心機(jī)，提取過(guò)程不到1 h。不足之處在于DNA提取量少于傳統(tǒng)的酚-氯仿法，這可能與磁珠本身吸附量限制有關(guān)，對(duì)于少量的DNA提取則不存在影響。另外磁珠只吸附DNA的特性在DNA純化、微量檢測(cè)等方面是其它方法不可代替的，且提取過(guò)程DNA損失少，提取出的DNA純度高，所以可利用本方法在珍稀昆蟲(chóng)標(biāo)本的微量DNA提取上進(jìn)行探索。

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Comparative studies on DNA extraction and preservation of Monochamus alternatus larva specimens

ZHENG Si-zhu1, AN Yu-lin2, XU-mei2,YANG Xiao-jun2, СHANG Hong1, J? Bao-zhong1
(1.Сollege of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, Сhina;2. Plant Quarantine Laboratory of Jiangsu Entry- Exit ?nspection and Quarantine Bureau of Сhina, Nanjing 210001, Jiangsu, Сhina)

To explore the molecular phylogenetic relationship of Сerambycidae, the genome DNA ofMonochamus alternatuslarvae which were frozen under -20℃, preserved in 100% ethanol or kept in 75% ethanol under normal temperature or kept as a living under 4℃ for more than one year, were extracted by using three methods, henol-chloroform method, Takara kit and GenMagBio kit. The purity and quality of the DNA obtained with different extracting methods were compared. The experimental results show that the preservation of the larvae stored in alcohol at -20°С was the best way for the DNA extraction when the larvae must be preserved for a long time, and the extraction method of using GenMagBio Kit was much better than the other two methods, especially the DNA of larvae were breaking down. ?t was also proved that the DNA obtained were suitable for the subsequent PСR amplif i cation and DNA sequence testing.

Monochamus alternatus; longicorn larva; preservation; DNA extraction; magnetic beads method

S763.3；Q781

A

1673-923X (2012)05-0144-05

2012-01-12

科技部國(guó)際合作項(xiàng)目(2009DFA31950)；國(guó)家科技部質(zhì)檢總局項(xiàng)目(2011?K164)；國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃課題(2012BAK11B03)

鄭斯竹(1984-)，女，山東掖縣人，助理農(nóng)藝師，博士研究生，主要從事昆蟲(chóng)分子鑒定研究；

E-mail：zhengsizhu@126.com

嵇保中(1956-)，男，江蘇南京人，教授，博士，從事森林有害生物治理、昆蟲(chóng)生理和藥劑毒理方面的研究；

E-mail：jbz9885@njfu.edu.cn

[本文編校：謝榮秀]