蔣桂香，李延平，劉中原，吳科鋒，劉 義，李 立

(1.廣東雙林生物制藥有限公司 湛江市生物制藥工程中心，廣東 湛江 524005;2.廣東醫(yī)學(xué)院 廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524023)

肝水解肽的制備及相對(duì)分子質(zhì)量分布研究

蔣桂香1，李延平2，劉中原2，吳科鋒2，劉 義2，李 立2

(1.廣東雙林生物制藥有限公司 湛江市生物制藥工程中心，廣東 湛江 524005;2.廣東醫(yī)學(xué)院 廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524023)

目的 研究肝水解肽的制備方法及相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)分布。方法 采用堿化-酶解法制備肝水解肽，采用高效液相色譜法測(cè)定肝水解肽的Mr。結(jié)果 采用堿化-酶解法制備肝水解肽收率穩(wěn)定，優(yōu)化的酶解法工藝參數(shù)為胰酶用量為0.5%、溫度為55℃、pH為7.5、水解時(shí)間為6 h，在此條件下酶解多肽提取率平均為4.82%;肝水解肽Mr400～10 000的組分占73%左右。結(jié)論 堿化-酶解法制備肝水解肽工藝簡(jiǎn)便可靠，能保持大部分多肽結(jié)構(gòu)。

肝水解肽;酶解;高效液相色譜法;相對(duì)分子質(zhì)量;分布

肝水解肽(heparolysate)是由健康哺乳動(dòng)物如牛、豬的肝臟經(jīng)水解提取制得的活性混合物，含有多肽類、氨基酸類、核酸類等物質(zhì)，能促進(jìn)正常肝細(xì)胞的增殖和再生，對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷有較好的保護(hù)作用，能降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶，促進(jìn)病變組織恢復(fù)，用于慢性肝炎、肝硬化等疾病的治療［1-2］。肝水解肽與促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的原料來源、成分相似，主要功能物質(zhì)包括10～100個(gè)氨基酸的多肽、肝細(xì)胞刺激因子(HSS)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)及多種游離氨基酸和微量元素［3］。生物技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了大量肽類藥物的出現(xiàn)，使得多肽的測(cè)定及鑒定技術(shù)日趨重要。對(duì)于多肽類物質(zhì)相對(duì)分子量(Mr)分布及其測(cè)定有多種方法，如滲透壓法、光散射法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳以及凝膠柱高效液相色譜法等。

肝水解肽是天然混合多肽，其活性很大程度上取決于其Mr的大小［4-5］。具有生理功能的調(diào)節(jié)因子都是Mr10 000以內(nèi)的肽類，采用不同的制備技術(shù)以及控制酶解條件，能夠獲得Mr適中的多肽物質(zhì)［6］。肝水解肽制備過程中，水解條件對(duì)于控制多肽Mr分布、保持多肽生物活性具有重要作用。本文以新鮮豬肝為原料，采用堿化-酶解法制備肝水解肽，優(yōu)化了酶解法制備多肽的工藝參數(shù)，并用高效液相色譜法確定了肝水解肽的Mr分布。

1 材料

新鮮豬肝購(gòu)自湛江某超市。選材標(biāo)準(zhǔn):外形健康正常，顏色紫紅，均勻有光澤，肝包膜平整光滑，肝實(shí)質(zhì)均勻柔軟，彈性好，切面整齊潤(rùn)滑，血管和肝小葉紋理清晰。

多肽對(duì)照品:細(xì)胞色素C(Mr12 000)、抑肽酶(Mr6 500)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(Gly-Gly-Try-Arg，Mr451 000) 及乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(Gly-Gly-Gly，Mr189 000)購(gòu)自 Sigma-Aldrich公司，純度≥98%;Lowry法蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司;胰蛋白酶購(gòu)自上海林葉生物有限公司。

Agilent 1200型高效液相色譜儀(包括G1311A四元泵，G1328B手動(dòng)進(jìn)樣器，G1315B二極管陣列檢測(cè)器，G1316A柱溫箱)，美國(guó)安捷倫科技公司;METTLER AE240型電子天平，梅特勒-托利多上海有限公司;Milli-Q超純水儀，美國(guó)密理博科技公司。

2 方法

2.1 肝水解肽溶液的制備

采用堿化-酶解法。取豬肝100 g，用水沖洗干凈，切成小片，放入粉碎機(jī)內(nèi)絞碎;加水600 mL，緩緩攪動(dòng)，待溫度加熱至指定溫度;用NaOH溶液調(diào)pH，加入相應(yīng)量的胰酶，在指定溫度下水解，不斷攪拌并保持pH;水解完畢，加HCl溶液調(diào)節(jié)pH至3.5～6.0，加熱至85 ℃保持 30 min;冷卻，4 000 r/min離心20 min，取上清，得到肝水解肽提取液。

2.2 含量測(cè)定

采用Lowry法。根據(jù)試劑盒說明書繪制蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，將制備的肝水解肽適當(dāng)稀釋，用蛋白含量測(cè)定試劑盒測(cè)定提取溶液中的多肽含量。

2.3 M r分布測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為TSKgel G 3000S WXL(300 mm×650 mm)，流動(dòng)相為乙腈-水-冰乙酸(10∶90∶1)，流速為 0.8 mL/min，二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為20μL。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取4種已知Mr的多肽對(duì)照品，用0.05%疊氮化鈉溶液制成0.5 mg/mL的溶液，進(jìn)樣20μL，記錄色譜圖，以對(duì)照品 Mr的對(duì)數(shù)(lg Mr)對(duì)保留時(shí)間(tR)線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

2.3.3 樣品Mr分布 取肝水解肽供試品溶液，采用0.22μm濾膜過濾，取20μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，把tR代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算Mr。用峰面積歸一法計(jì)算得出不同Mr范圍的相對(duì)百分比。

3 結(jié)果

3.1 肝水解肽的制備工藝優(yōu)化

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，酶解過程中，胰酶的用量(A)、酶解溫度(B)、反應(yīng)pH值(C)以及酶解時(shí)間(D)對(duì)于水解肽的含量有顯著影響，因此設(shè)計(jì)上述4因素3水平的正交設(shè)計(jì)表，以水解肽的提取率為考察指標(biāo)優(yōu)化酶解過程，提取率(%)=制備液肝水解肽含量/原料豬肝重量×100%。正交設(shè)計(jì)表及結(jié)果見表1～2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factor and level of orthogonal test

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal test

由表2極差分析可以看出，最佳條件是A3B2C1D2，即酶用量為0.5%、溫度為55℃、pH 為7.5、水解時(shí)間為6 h時(shí)提取率最高。由極差分析可知，影響提取率的最主要因素是水解時(shí)間，其次是酶用量，再次是溫度，影響最小的是pH。

3.2 肝水解肽含量測(cè)定

Lowry法測(cè)定蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線性方程為y=1.544 x －0.126，r=0.996 5。蛋白質(zhì)含量在 0.025～0.5 mg/mL范圍內(nèi)線性良好，可用于測(cè)定提取液中多肽含量。

采用優(yōu)化的工藝參數(shù)制備肝水解肽3批，詳細(xì)操作為:取豬肝250 g，用水洗凈，切成小片后絞碎;加水1 500 mL，緩緩攪動(dòng);加熱到55℃左右，用NaOH溶液調(diào)pH至7.5;加入肝重量0.5%的胰酶，在55℃水解6 h，不斷攪拌，保持 pH 7.5;水解完畢，加HCl溶液調(diào)節(jié) pH至3.5，加熱至85℃保持30 min;冷卻，4 000 r/min 離心20 min，取上清，得到提取溶液;稀釋20倍后，用Lowry法試劑盒測(cè)定提取液中的多肽含量，并計(jì)算提取率。結(jié)果見表3?？梢?，優(yōu)化的堿化-酶解法提取多肽含量高，提取率穩(wěn)定。

表3 優(yōu)化工藝制備肝水解肽實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of the heparolysate preparation under optimum conditions

3.3 肝水解肽M r分布的測(cè)定

多肽對(duì)照品及肝水解肽樣品色譜圖見圖1。Mr測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:lg Mr=－0.210 6 tR+5.632 2，r=0.993 5。

圖1 多肽對(duì)照品(A)和肝水解肽供試品(B)的M r分布色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of polypeptides references(A)and sample(B)

肝水解肽供試品溶液的Mr分布見表4。從表4可知Mr＞400部分約占73%，＜70部分約為22%，得出肝水解肽中Mr為 400～10 000的肽類約占73%。

4 討論

通過技術(shù)手段如酶水解法或膜法提取技術(shù)所獲得的肝源性(以豬、牛多見)生物活性肽具有免疫增強(qiáng)作用、促進(jìn)肝臟再生作用、對(duì)肝損傷的保護(hù)作用、改善肝炎癥狀等多種重要生理功能［7］。

肝水解肽溶液制備沒有統(tǒng)一的生產(chǎn)工藝，目前有廠家采用胃蛋白酶進(jìn)行水解的工藝，水解速度慢，時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，夏季生產(chǎn)必須添加適量防腐劑，且水解后雜蛋白的去除率低，制成制劑后容易出現(xiàn)沉淀和白點(diǎn)現(xiàn)象［8］。本工藝采用胰酶，在堿化條件下酶解，制備的肝水解肽樣品質(zhì)量穩(wěn)定可靠，Mr在400以上的肽約占73%，表明產(chǎn)品的主要成分是肽類。肽類是由多個(gè)氨基酸縮合而成，其Mr介于大分子蛋白質(zhì)和小分子氨基酸之間。大分子蛋白質(zhì)由于是人體異種蛋白，給藥后易產(chǎn)生嚴(yán)重的抗原抗體反應(yīng)，而小分子氨基酸缺乏特異的分子空間結(jié)構(gòu)，不具備特殊的生理活性，給藥后主要起到營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充的作用。肝水解肽是天然混合多肽，其活性很大程度上取決于其Mr的大小。采用本工藝制備的肝水解肽含量高，在縮短制備周期的同時(shí)，確保產(chǎn)品的安全性及質(zhì)量要求。

肝源性生物活性肽是一類Mr小、且具有多種重要生物學(xué)功能的肽類。目前，臨床中治療肝炎肝硬化只是利用了肝源性生物活性肽眾多生物活性的一小部分，對(duì)其進(jìn)一步深入開發(fā)極其必要［9-10］。由于生物活性肽為多肽，在某種程度上存在穩(wěn)定性差、易被消化道中的酶所破壞等缺點(diǎn)，因此目前此類藥物以注射劑型為主，不僅使用不便，而且有報(bào)道稱此類制劑可引發(fā)嚴(yán)重過敏反應(yīng)［11］，在一定程度上限制了此類藥物的發(fā)展;而新型口服給藥技術(shù)的進(jìn)步，如蛋白多肽的口服結(jié)腸靶向給藥技術(shù)，可能為此類藥物的應(yīng)用打開更為廣闊的前景。

表4 肝水解肽的M r分布Tab.4 Molecular weight distribution in sample

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Study on preparation method and molecular weight distribution of polypeptide in heparolysate

JIANG Gui-xiang1，LI Yan-ping2，LIU Zhong-yuan2，WU Ke-feng2，LIU Yi2，LI Li2
(1.Guangdong Shuanglin Biopharmaceatical Co.，Ltd.，the Engineering Center of Zhanjiang Biopharmacy，Zhanjang 524005，China;2.Guangdong Medical College，Guangdong Key Laboratory for Research and Development of Natural Drugs，Zhanjiang 524023，China)

Purpose To study the preparation technique and to establish a method for determining the molecular weight(Mr)distribution of polypeptide in heparolysate.Methods The heparolysate was prepared by basification-enzymolysis method，and the Mrdistribution was determined by HPLC.Results The optimum preparation data were as follows，the dosage of pancreatin 0.5%，55 ℃，pH 7.5 and the time of enzymolysis 6 h.The average yield of heparolysate was 4.82%，in the Mrrange of 400-10 000 D.There was a good linear relationship between the logarithm of Mrof peptide and the retention time(r=0.993 5)，and the peptides with Mr＞400 D were about 73%in all the enzymolysis solutions.Conclusion The technique is simple and reproducible for the preparation of heparolysate.

heparolysate;enzymolysis;HPLC;molecular weight;distribution

TQ464.54

A

1005-1678(2012)05-0603-04

2011-09-20

東莞市高等院校科研機(jī)構(gòu)和醫(yī)療衛(wèi)生單位科技計(jì)劃項(xiàng)目(2008108101059)

蔣桂香，女，制藥工程師，主要從事生物制品質(zhì)量控制工作;李 立，男，通信作者，博士，副研究員，主要從事天然藥物及腫瘤分子病理研究，E-mail:LL524@yahoo.cn。