李 昀，王航寧，邵明瑜，張志峰

（中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003）

生殖腺是兩性生殖細(xì)胞產(chǎn)生和分化的場(chǎng)所，研究生殖腺發(fā)生可以更好地調(diào)控物種的繁殖性能，提高種質(zhì)特性，開(kāi)發(fā)和利用優(yōu)異的品種資源。這無(wú)論在理論上還是人工繁殖及資源開(kāi)發(fā)利用等實(shí)際應(yīng)用中都具有重要的意義。

單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus）俗稱(chēng)“海腸子”，隸屬于螠蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)（Echiuroidea）、螠綱（Echiurida）、無(wú)管螠目（Xenopneusta）、刺螠科（Urechidae）、刺螠屬（Urechis），是無(wú)管螠目在我國(guó)沿海分布的唯一種類(lèi)［1］，具有很高的經(jīng)濟(jì)食用價(jià)值和改良底質(zhì)的能力［2］，是一類(lèi)亟待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的海洋動(dòng)物資源。然而目前人們對(duì)單環(huán)刺螠生殖腺是如何發(fā)生的、性腺的形態(tài)結(jié)構(gòu)及發(fā)育特點(diǎn)尚不清楚，這大大地限制了人們對(duì)該物種繁殖生物學(xué)以及養(yǎng)殖開(kāi)發(fā)的研究。本實(shí)驗(yàn)以幼螠和成體單環(huán)刺螠為材料，采用組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法對(duì)單環(huán)刺螠生殖腺的發(fā)生，卵巢的結(jié)構(gòu)及年周期發(fā)育進(jìn)行了觀察，旨在為單環(huán)刺螠生殖生物學(xué)及人工繁育提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

實(shí)驗(yàn)用單環(huán)刺螠成體購(gòu)自青島市南山海產(chǎn)品市場(chǎng)，產(chǎn)地為萊州海區(qū)，體長(zhǎng)10～20 cm，體質(zhì)量100～300 g。每月取樣1次，共70只。幼螠由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)獲得。選擇生殖期腎管飽滿(mǎn)的雌、雄個(gè)體，解剖從腎管中獲取成熟兩性生殖細(xì)胞，人工受精（精、卵數(shù)量8∶1）。受精卵經(jīng)3次洗卵后轉(zhuǎn)入50 cm×30 cm×30 cm的培養(yǎng)箱中充氣培養(yǎng)。水溫為室溫（16～20℃），p H 7.9±0.05，鹽度29±1。48 h后每天早晚各1次投喂小球藻、金藻等單胞藻。體節(jié)幼蟲(chóng)后轉(zhuǎn)入含沙泥底質(zhì)的水缸中，底質(zhì)厚6 cm，培養(yǎng)密度為0.2 ind／cm2。在Nikon E80i型顯微鏡下觀察單環(huán)刺螠的發(fā)育，選取1～4 cm的幼螠用于組織學(xué)觀察。

游離生殖細(xì)胞的獲?。翰捎米⑸淦鞔┩阁w壁抽取含有生殖細(xì)胞的體腔液，2 000 r／min離心，棄掉上層體腔液細(xì)胞，收集各期生殖母細(xì)胞，Nikon E80i顯微鏡下觀察和拍照。

組織學(xué)觀察：?jiǎn)苇h(huán)刺螠幼螠用飽和MgSO4麻醉后，Bouin’s固定液固定24 h；對(duì)于成熟個(gè)體，剪取其雌性個(gè)體尾部蟲(chóng)體，固定于Bouin’s溶液中24 h。酒精梯度脫水，石蠟包埋，美國(guó)AO輪式切片機(jī)連續(xù)切片，厚度5～7μm，H＆E染色，Nikon E80i顯微鏡下觀察、測(cè)量和拍照。

2 結(jié)果

2.1 單環(huán)刺螠性腺的發(fā)生和卵巢的結(jié)構(gòu)

作者最早在3.5 cm體長(zhǎng)的單環(huán)刺螠幼螠尾部后腸外壁處的結(jié)締組織中，發(fā)現(xiàn)了原始生殖細(xì)胞（Primodial germ cells，PGCs）樣的細(xì)胞。這些細(xì)胞胞體較大，直徑約4μm，核大而圓，核仁明顯，胞質(zhì)透明并呈弱嗜堿性；此期幼螠連續(xù)切片觀察，PGCs數(shù)量接近10個(gè)，它們和周?chē)慕Y(jié)締組織一起構(gòu)成了生殖腺原基（見(jiàn)圖1－1，2）。發(fā)育至4 cm的幼螠，構(gòu)成性腺原基的細(xì)胞進(jìn)一步增殖，且生殖干細(xì)胞主要位于原基的外圍，結(jié)締組織被包圍其中（見(jiàn)圖1－3，4），性腺的基本結(jié)構(gòu)已具備。此期生殖細(xì)胞處于性原細(xì)胞階段，未見(jiàn)分化的生殖細(xì)胞產(chǎn)生。隨著發(fā)育的進(jìn)行，生殖腺進(jìn)一步伸長(zhǎng)，并通過(guò)肌束將性腺兩端的結(jié)締組織固著在后腸壁和體壁上。

圖1 單環(huán)刺螠生殖腺的發(fā)生和卵巢結(jié)構(gòu)的年周期變化Fig.1 Gonad genesis and ovary annual development of Urechis unicinctus

單環(huán)刺螠的卵巢極小，呈條帶狀，位于蟲(chóng)體尾部后腸處。生長(zhǎng)期和成熟期的卵巢長(zhǎng)度也僅有900μm左右，因此肉眼不易辨認(rèn)。光鏡下可見(jiàn)各期卵母細(xì)胞位于卵巢外周，同一發(fā)育時(shí)期的卵母細(xì)胞往往聚集成團(tuán)，卵巢內(nèi)部為疏松結(jié)締組織，結(jié)構(gòu)相對(duì)疏松，膠原纖維豐富，偶爾可見(jiàn)排列疏松的肌纖維分布；在卵巢兩端形成發(fā)達(dá)的肌束。卵巢中的生殖細(xì)胞包括卵原細(xì)胞、小生長(zhǎng)期卵母細(xì)胞、卵黃發(fā)生早期卵母細(xì)胞和卵黃發(fā)生時(shí)期的卵母細(xì)胞（見(jiàn)圖1－10～15）。

2.2 卵巢年周期發(fā)育

通過(guò)對(duì)全年樣品切片觀察發(fā)現(xiàn)，單環(huán)刺螠一年中出現(xiàn)2個(gè)生殖期，一次發(fā)生在春季（大生殖期）的4月中下旬至5月底，持續(xù)時(shí)間可達(dá)50 d左右；另一次為秋季（小生殖期），發(fā)生于9月份，約持續(xù)30 d。根據(jù)卵巢的組織結(jié)構(gòu)以及體腔液中生殖細(xì)胞的發(fā)育特點(diǎn)，將單環(huán)刺螠雌體的性腺發(fā)育周期劃分為5個(gè)時(shí)期，即增殖期、生長(zhǎng)期、成熟期、排放期和休止期。

2.2.1 增殖期 6月末～7月和11月～次年1月，卵巢長(zhǎng)度為200～800μm，卵巢中僅見(jiàn)外周的卵原細(xì)胞成團(tuán)分布。卵原細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量隨著卵巢的發(fā)育逐漸增加，從卵巢的最大切面觀察，可見(jiàn)每個(gè)細(xì)胞團(tuán)的卵原細(xì)胞數(shù)量約為7～9個(gè)（見(jiàn)圖1－10，11）。此階段體腔液中游離的卵母細(xì)胞團(tuán)數(shù)量很少，腎管萎縮（見(jiàn)圖1－5）。

2.2.2 生長(zhǎng)期 7月末～8月下旬和2月～4月初，卵巢長(zhǎng)度為800～900μm，卵巢內(nèi)可見(jiàn)卵原細(xì)胞和卵母細(xì)胞（見(jiàn)圖1－12）。7月末～8月中旬和2～3月，卵母細(xì)胞團(tuán)開(kāi)始出現(xiàn)在卵巢中部的結(jié)締組織中，但數(shù)量明顯少于卵原細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量；8月中旬～8月下旬和3月下旬～4月初，卵巢中卵原細(xì)胞團(tuán)數(shù)量逐漸減少，卵母細(xì)胞團(tuán)數(shù)量迅速增多，并充滿(mǎn)卵巢中部，成為此時(shí)期卵巢中主要生殖細(xì)胞；在這些卵母細(xì)胞團(tuán)中，以小生長(zhǎng)期和卵黃發(fā)生早期的卵母細(xì)胞團(tuán)為主，卵黃發(fā)生時(shí)期的卵母細(xì)胞數(shù)量少，且單個(gè)分布；進(jìn)一步可見(jiàn)此期由于卵母細(xì)胞團(tuán)脫落，而使卵巢邊緣不完整，部分結(jié)締組織膜破裂。生長(zhǎng)期個(gè)體的體腔液中卵母細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量迅速增加，進(jìn)入8月中下旬和3月末后，細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量減少，而游離卵母細(xì)胞數(shù)量增多（見(jiàn)圖1－6，7）。

2.2.3 成熟期 8月末～9月中旬和4月～5月初，卵巢長(zhǎng)度為800μm左右，其結(jié)構(gòu)組成與生長(zhǎng)期末期相似，卵原細(xì)胞數(shù)量很少，卵巢中充滿(mǎn)了卵母細(xì)胞，其中卵黃發(fā)生時(shí)期卵母細(xì)胞數(shù)量最多（見(jiàn)圖1－13）。體腔液中主要以游離的卵母細(xì)胞為主，卵母細(xì)胞團(tuán)較少（見(jiàn)圖1－8）。此階段腎管飽滿(mǎn)，充滿(mǎn)了大量的成熟卵子。

2.2.4 排放期 9月下旬～10月中旬和5月中旬～6月中旬，卵巢長(zhǎng)度為600μm左右，卵巢中的生殖細(xì)胞驟減，主要為卵原細(xì)胞，卵母細(xì)胞急劇減少（見(jiàn)圖1－14）。體腔液中卵母細(xì)胞團(tuán)和游離卵母細(xì)胞的數(shù)量均逐漸減少。腎管中的生殖細(xì)胞已基本排放干凈或殘留少量，腎管迅速萎縮。

2.2.5 休止期 10月下旬～11月初和6月中旬～下旬，卵巢萎縮至100～200μm，生殖細(xì)胞團(tuán)由單一的卵原細(xì)胞構(gòu)成（見(jiàn)圖1－15）。體腔液中幾乎沒(méi)有生殖細(xì)胞（見(jiàn)圖1－9），腎管完全萎縮。

3 討論

3.1 單環(huán)刺螠生殖腺的發(fā)生與卵巢的結(jié)構(gòu)

生殖腺是由生殖細(xì)胞和體細(xì)胞共同組成的。一般來(lái)講，生殖細(xì)胞源于原始生殖細(xì)胞PGCs，后者多數(shù)情況下又往往在非生殖腺發(fā)生的地方產(chǎn)生，然后經(jīng)過(guò)遷移抵達(dá)生殖嵴，與生殖嵴的體細(xì)胞共同構(gòu)成原始的生殖腺；伴隨著個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育，在性染色體、性激素或者環(huán)境因子的影響下，原始性腺分化為精巢或卵巢，并最終成熟［3］。由于不同動(dòng)物的體制和進(jìn)化地位不同，其PGCs和生殖嵴發(fā)生的位置和時(shí)間也存在一定程度的差異［4］。本實(shí)驗(yàn)中作者最早在3.5 cm幼螠尾部后腸的外壁處觀察到生殖腺原基，它是由少量PGCs和后腸外壁局部的結(jié)締組織構(gòu)成。至4 cm幼螠時(shí)，性腺的基本結(jié)構(gòu)已經(jīng)具備。盡管隨著發(fā)育，性腺的體積將有一定的增大，但比較而言單環(huán)刺螠的生殖腺極小，成熟期的性腺也僅有900μm，肉眼難于分辨。推測(cè)這也是多年來(lái)人們研究螠蟲(chóng)動(dòng)物性腺發(fā)生沒(méi)有成功的原因之一。本研究首次給出了螠蟲(chóng)動(dòng)物生殖腺發(fā)生的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

從進(jìn)化上來(lái)看，動(dòng)物的生殖腺經(jīng)歷了由無(wú)定型（無(wú)固定形態(tài)和發(fā)生位置）到定型（固定的形態(tài)和發(fā)生位置）的演化。之前通過(guò)分離觀察螠蟲(chóng)動(dòng)物體腔液中的生殖細(xì)胞，認(rèn)為螠蟲(chóng)動(dòng)物生殖細(xì)胞的大部分發(fā)生過(guò)程都游離于體腔內(nèi)進(jìn)行，繁殖期時(shí)體腔膜可臨時(shí)用來(lái)產(chǎn)生生殖干細(xì)胞（卵原細(xì)胞或精原細(xì)胞），在體腔液中發(fā)育成熟后轉(zhuǎn)入腎管，排出體外［5］。本實(shí)驗(yàn)首次顯示了單環(huán)刺螠卵巢為長(zhǎng)期存在的一個(gè)固定性的結(jié)構(gòu)，其由蟲(chóng)體后腸壁外的局部結(jié)締組織和生殖細(xì)胞共同構(gòu)成，為膜帶狀；生殖細(xì)胞成團(tuán)或單個(gè)狀分布于其中；性腺兩端通過(guò)肌束固定在后腸的外壁和附近的體壁上，其結(jié)構(gòu)相對(duì)于高等無(wú)脊椎動(dòng)物的定型生殖腺而言要簡(jiǎn)單得多。單環(huán)刺螠生殖腺既沒(méi)有明顯而發(fā)達(dá)的結(jié)締組織外膜，也沒(méi)有排出管；卵巢中分布有不同發(fā)育時(shí)期的生殖母細(xì)胞（卵原細(xì)胞、不同發(fā)育時(shí)期的卵母細(xì)胞），它們以卵原細(xì)胞團(tuán)或者單個(gè)較大的卵母細(xì)胞的形式由卵巢的結(jié)締組織膜中脫離，并落入體腔中進(jìn)一步發(fā)育，成熟的卵母細(xì)胞將進(jìn)入腎管并排出體外，等待受精。因此單環(huán)刺螠卵子成熟前經(jīng)歷了2個(gè)發(fā)育場(chǎng)所（卵巢和體腔），這種方式與其近親環(huán)節(jié)動(dòng)物［6］和星蟲(chóng)動(dòng)物［7］有很大的相似性，均屬于由低等性腺類(lèi)型向高等類(lèi)型進(jìn)化的過(guò)渡類(lèi)型。

螠蟲(chóng)動(dòng)物是從環(huán)節(jié)動(dòng)物中分出的一個(gè)小門(mén)，由此二者在特征上既有相似又有差異，最典型的是二者在發(fā)育過(guò)程中都有體節(jié)產(chǎn)生，但是前者在體節(jié)幼蟲(chóng)之后，體節(jié)消失，因此體節(jié)僅在其個(gè)體發(fā)育較短的時(shí)期內(nèi)存在；而環(huán)節(jié)動(dòng)物則終生保持分化特征。這種分化差異或許也是導(dǎo)致它們的生殖腺分布、結(jié)構(gòu)以及生殖細(xì)胞在其中發(fā)育持續(xù)時(shí)間存在差異的原因之一。Clank和Oliue調(diào)查了14個(gè)科的多毛類(lèi)動(dòng)物卵巢的分布情況并將其分為2種類(lèi)型：一種是性腺分布于身體前端的少量體節(jié)中，另一種是在大量體節(jié)中重復(fù)分布［8］。2種類(lèi)型的共性是性腺按照體節(jié)重復(fù)分布。單環(huán)刺螠明顯的性腺結(jié)構(gòu)發(fā)生于幼螠，此時(shí)蟲(chóng)體的體節(jié)已消失，因此其性腺未表現(xiàn)出環(huán)節(jié)動(dòng)物樣的分節(jié)分布特征，而是在體后部后腸附近極小的范圍內(nèi)發(fā)生，這種性腺不按體節(jié)分布的特征與同樣由環(huán)節(jié)動(dòng)物分出的另一個(gè)小門(mén)動(dòng)物—星蟲(chóng)動(dòng)物是一致的。星蟲(chóng)動(dòng)物的卵巢也沒(méi)有按節(jié)律分布，其位于身體前端腹側(cè)收吻肌的基部，為指狀小葉組成的帶狀結(jié)構(gòu)［7］。3類(lèi)動(dòng)物中，星蟲(chóng)的生殖腺由于外由腹膜包被，內(nèi)部各期生殖細(xì)胞（性原細(xì)胞，初級(jí)性母細(xì)胞，次級(jí)性母細(xì)胞）均有分布，可謂是較高等的類(lèi)型［9］；單環(huán)刺螠次之，其卵巢中存在卵原細(xì)胞和早期初級(jí)卵母細(xì)胞，但無(wú)發(fā)達(dá)的結(jié)締組織膜包被；最低等的應(yīng)該是環(huán)節(jié)動(dòng)物多齒圍沙蠶，它沒(méi)有固定的生殖腺，生殖腺由局部體隔膜上皮分化而來(lái)，卵巢內(nèi)只存在卵原細(xì)胞［6］。

由上可見(jiàn)，3類(lèi)動(dòng)物生殖腺既存在相似性，說(shuō)明它們存在親緣關(guān)系；又存在差異。且性腺的差異性一定程度上與其物種進(jìn)化關(guān)系是一致的。

3.2 單環(huán)刺螠卵巢的年發(fā)育周期

一般來(lái)講，動(dòng)物由幼體到成體的時(shí)期，同時(shí)也是性腺發(fā)育和成熟的時(shí)期。第一次性腺成熟對(duì)不少種類(lèi)的動(dòng)物來(lái)說(shuō)是一生中的唯一經(jīng)歷，但對(duì)大量的海洋無(wú)脊椎動(dòng)物來(lái)說(shuō)，在一生中都有著多次性腺成熟的現(xiàn)象。在這種情況下，性腺在前一次發(fā)育成熟并排出精卵后即進(jìn)入休止時(shí)期，待新的內(nèi)外條件具備時(shí)再進(jìn)入下一次發(fā)育過(guò)程。正是這種形態(tài)和生理變化的周而復(fù)始形成了性腺發(fā)育的周期性。

利用組織學(xué)方法，根據(jù)單環(huán)刺螠不同時(shí)期卵巢的大小、結(jié)構(gòu)組成及體腔液中生殖細(xì)胞的發(fā)育狀況，作者將單環(huán)刺螠卵巢年周期發(fā)育分為5個(gè)時(shí)期：增殖期（6月末～7月和11月～次年1月）、生長(zhǎng)期（7月末～8月下旬和2月～4月初）、成熟期（8月末～9月中旬和4月～5月初）、排放期（9月下旬～10月中旬和5月中旬～6月中旬）和休止期（10月下旬～11月初和6月中旬～下旬）。與單環(huán)刺螠的生殖期（春季：4月下旬～5月下旬；秋季：9月中旬～10月中旬）相比，卵巢的成熟期與生殖期并不完全同步，性腺成熟期比繁殖期稍早。本實(shí)驗(yàn)性腺的年發(fā)育周期和生殖周期的研究結(jié)果將為深入進(jìn)行單環(huán)刺螠生殖生物學(xué)研究以及該物種苗種繁育及增養(yǎng)殖開(kāi)發(fā)具有促進(jìn)作用。

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