韓鵬 梁媛媛 趙昱 劉陽 楊潤琴 鄧志宏

聲帶是發(fā)聲的主要器官，其固有層的組織結(jié)構(gòu)是正常發(fā)聲的基礎(chǔ)。手術(shù)、外傷、慢性炎癥均有可能導(dǎo)致聲帶固有層損傷，造成細(xì)胞外基質(zhì)成分的正常結(jié)構(gòu)破壞，大量纖維組織增生、排列紊亂，從而產(chǎn)生瘢痕導(dǎo)致發(fā)聲障礙。目前用于治療聲帶損傷的方法主要為聲帶注射術(shù)，通過注射生物材料作為填充物，以減少聲帶瘢痕的形成，而術(shù)后對瘢痕愈合過程的觀察多限于大體形態(tài)觀察，包括損傷處局部有無充血、水腫、萎縮及瘢痕形成等。對聲帶細(xì)胞外基質(zhì)成分的變化缺乏敏感指標(biāo)，聲帶固有層細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分主要包括膠原纖維、彈力纖維、透明質(zhì)酸和纖維連接蛋白(fibronectin)。膠原纖維起ECM的支架作用，聲帶損傷后其含量增加，呈粗而排列紊亂的纖維束；彈力纖維可以維持組織的彈力，損傷后其含量下降，排列紊亂；透明質(zhì)酸影響聲帶的粘彈力，損傷后含量持續(xù)下降；纖維連接蛋白則是纖維化過程的前驅(qū)物質(zhì)，損傷后含量持續(xù)增加[1～5]。因此，這些成分的變化可以在組織水平反應(yīng)聲帶固有層損傷后的修復(fù)情況。

為更好的觀察各種材料對聲帶損傷的修復(fù)作用，建立完善的聲帶損傷動物模型十分關(guān)鍵。目前常用的聲帶損傷動物模型有小鼠、大鼠、兔及犬模型等。因犬聲帶組織結(jié)構(gòu)與人相近，是理想的實(shí)驗(yàn)動物[6,7]。聲帶手術(shù)導(dǎo)致的損傷常見的有激光造成的熱損傷及手術(shù)器械造成的銳性損傷，半導(dǎo)體激光因其出血少等優(yōu)點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于嗓音外科[8～11]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用犬為實(shí)驗(yàn)動物，模擬臨床激光手術(shù)，在支撐喉鏡下用半導(dǎo)體激光損傷雙側(cè)聲帶，觀察術(shù)后聲帶愈合的大體形態(tài)及組織學(xué)變化，為下一步用干細(xì)胞修復(fù)聲帶損傷的實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康成年中華田園犬5只，體重10～15 kg，隨機(jī)編為1、2、3、4、5號犬，1號為對照組，2～5號為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)動物由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)期間在第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院動物中心飼養(yǎng)。

1.2主要材料及器材 支撐喉鏡(定制)，半導(dǎo)體激光儀(Leica)，冷光源(Olympus)，0o內(nèi)鏡(Stryker)，視頻記錄系統(tǒng)(Sony)，冰凍切片機(jī)(Leica)，抗Fibronectin抗體(1:100 abcam)，Masson三色染色、Elastin VG、愛先藍(lán)染色套裝(珠海貝索生物)。

1.3犬聲帶損傷模型建立方法 動物術(shù)前禁食12 小時，制動后稱重，經(jīng)后肢肌肉注射速眠新0.1 mg/kg，戊巴比妥鈉0.2 mg/kg。麻醉后將動物固定于手術(shù)臺，將2～5號犬在支撐喉鏡下暴露雙側(cè)聲帶，局部噴少量利多卡因，半導(dǎo)體激光10 W點(diǎn)狀損傷雙側(cè)聲帶膜部中后1/3段，面積約8 mm2，深達(dá)甲杓肌。術(shù)后3 d連續(xù)肌肉注射慶大霉素2 ml/只。1號犬不作任何處理，作為對照組。

1.4大體形態(tài)學(xué)及組織學(xué)觀察 分別于術(shù)后4 d、2、4、8 w在支撐喉鏡下觀察聲帶創(chuàng)傷大體愈合情況后，各處死一只犬，于聲帶損傷處取材，一側(cè)聲帶冰凍切片行免疫組化Fibronectin染色，另一側(cè)石蠟切片行HE染色觀察聲帶的炎癥情況及Masson三色染色、Elastin VG染色、愛先藍(lán)染色分別觀察膠原、彈力纖維、透明質(zhì)酸的變化。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 組織切片40倍顯微鏡下觀察聲帶固有層結(jié)構(gòu)，100倍顯微鏡下通過PhotoshopCS3軟件對固有層細(xì)胞外基質(zhì)成分進(jìn)行全層量化數(shù)據(jù)分析，計算各個時間點(diǎn)聲帶固有層中膠原、彈力纖維、透明質(zhì)酸及纖維連接蛋白的面積同固有層面積的百分比，每側(cè)任意選3張切片行計量分析。

2 結(jié)果

2.1術(shù)后犬聲帶大體形態(tài)變化 術(shù)后動物均健康存活，支撐喉鏡下見正常聲帶表面呈白色，粘膜光滑。術(shù)后4 d(2號犬)雙側(cè)聲帶充血、水腫，處于急性炎癥期；術(shù)后2 w(3號犬)雙側(cè)聲帶充血水腫減輕，表面覆有偽膜；4 w(4號犬)時損傷部位基本愈合，表面不規(guī)則且瘢痕形成，無明顯水腫或萎縮；8 w(5號犬)時可見聲帶瘢痕，損傷局部萎縮(圖1)。

2.2組織學(xué)變化

2.2.1HE染色結(jié)果 正常聲帶表面被覆復(fù)層扁平上皮，下為結(jié)締組織構(gòu)成的固有層，主要含有膠原纖維、彈力纖維、纖維連接蛋白及透明質(zhì)酸。術(shù)后4 d，雙側(cè)聲帶損傷處未被上皮覆蓋，局部大量炎性細(xì)胞浸潤及血管形成；術(shù)后2 w受損部位已被上皮完全覆蓋，炎性細(xì)胞較前減少；4 w時受損聲帶固有層被致密的纖維組織所替代，大量纖維組織無序排列；8 w時纖維組織有所增粗，排列紊亂，但局部無明顯炎性細(xì)胞浸潤。由于炎癥反應(yīng)，術(shù)后2 w開始固有層出現(xiàn)大量腺體增生，至8 w時腺體未減少(圖2a～e)。

圖1 支撐喉鏡下所見正常、激光損傷即刻、損傷后各觀察時間點(diǎn)犬聲帶形態(tài)

圖2 聲帶組織HE染色及Masson三色染色圖片

圖3 聲帶組織EVG及愛先藍(lán)染色圖片

圖4 免疫組化DAB顯色圖片(×100)

2.2.2特殊染色及免疫組化觀察固有層ECM變化 Masson三色染色示膠原在正常聲帶內(nèi)主要分布在固有層深層；2 w時膠原含量持續(xù)增加，膠原間夾雜大量腺體；4 w時膠原纖維呈條索狀，排列紊亂，含量持續(xù)增加；8 w時膠原呈粗大條索狀，分布紊亂，含量增加(圖2f～i)。EVG染色示正常犬聲帶內(nèi)彈力纖維主要分布在固有層中層；術(shù)后2 w時其含量減少，排列紊亂；4 w時含量持續(xù)降低，纖維束較細(xì)；8 w時含量趨于穩(wěn)定，排列略顯紊亂(圖3a～d )。愛先藍(lán)染色示透明質(zhì)酸在正常聲帶內(nèi)分布于固有層全層，術(shù)后2 w時含量降低，隨后含量持續(xù)下降(圖3e～h)。

免疫組化染色示纖維連接蛋白在正常犬聲帶內(nèi)位于固有層全層，淺層含量略多。損傷后2 w至4 w，其含量持續(xù)增加，損傷后8 w時，含量略有上升(圖4a～d )。損傷后各組動物聲帶固有層細(xì)胞外基質(zhì)成分含量的變化見表1。因術(shù)后4 d時聲帶充血水腫明顯，膠原纖維與肌組織結(jié)構(gòu)混亂，各種ECM成分含量不易檢測，故表1中無術(shù)后4 d的數(shù)據(jù)。

3 討論

研究聲帶損傷的修復(fù)需要相應(yīng)的聲帶損傷動物模型，既往有學(xué)者選用小鼠、大鼠、兔及犬模型等[12～15]，由于不同種屬動物組織結(jié)構(gòu)不同，獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)差異較大，小鼠和大鼠雖易飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作，但其聲帶偏短不利于行聲帶注射術(shù)，且術(shù)后愈合情況不易觀察；兔的聲帶雖較長，但由于解剖原因兔聲帶不易暴露，手術(shù)多采用喉裂開方式，創(chuàng)傷較大；犬易飼養(yǎng)，其聲帶組織結(jié)構(gòu)與人類相近，較適合作為實(shí)驗(yàn)動物。因此，本實(shí)驗(yàn)選用犬為研究對象，模擬臨床激光手術(shù)，建立了激光損傷犬雙側(cè)聲帶的動物模型。

表1 對照組及損傷后不同時間犬聲帶固有層中膠原、彈力纖維、透明質(zhì)酸及纖維連接蛋白含量的變化(%)(n=1)

既往Tateya等[16]在內(nèi)窺鏡下用顯微鑷將大鼠聲帶固有層剝離，術(shù)后2、4及8 w分別觀察聲帶固有層ECM的改變，結(jié)果顯示隨著時間的推移，術(shù)后聲帶中膠原纖維含量持續(xù)增加，透明質(zhì)酸含量持續(xù)下降，纖維連接蛋白含量持續(xù)上升。Rousseau等[17]在內(nèi)窺鏡下用顯微剪將犬聲帶固有層與肌層銳性分離，分別于術(shù)后2、6月時觀察聲帶內(nèi)膠原纖維、彈力纖維、透明質(zhì)酸、纖維連接蛋白的含量，結(jié)果示術(shù)后2月時聲帶固有層膠原含量上升，彈力纖維含量下降，膠原纖維及透明質(zhì)酸含量與對照組無明顯差別，術(shù)后6月時膠原含量上升，彈力纖維含量下降，透明質(zhì)酸含量與對照組無顯著性差異。本研究結(jié)果顯示，激光損傷犬聲帶后4 d時，聲帶表面充血水腫，膠原纖維與肌組織結(jié)構(gòu)混亂，各種ECM成分不易檢測，術(shù)后2 w時膠原纖維增生，固有層細(xì)胞合成大量ECM成分修復(fù)缺損，術(shù)后4～8 w時膠原含量增加，纖維連接蛋白含量略上升，此期瘢痕組織漸趨于成熟，與上述學(xué)者的研究結(jié)果基本相符。說明半導(dǎo)體激光損傷聲帶的效果與使用顯微剪、顯微鑷損傷固有層的效果無明顯差別，提示半導(dǎo)體激光熱損傷是一種可行的建立聲帶損傷動物模型的方式。

綜上所述，支撐喉鏡下應(yīng)用半導(dǎo)體激光造成犬聲帶膜部熱損傷，損傷后聲帶固有層內(nèi)大量纖維組織形成，膠原含量上升，彈力纖維含量降低，透明質(zhì)酸含量降低，纖維連接蛋白含量上升，為研究聲帶損傷的修復(fù)提供了可靠的動物模型。

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