趙萬利, 包全英, 趙澤愷, 張 燦
(中國藥科大學(xué)新藥研究中心,江蘇南京210009)
水凝膠為可吸水溶脹的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具有很高的含水量、柔軟度和生物相容性,在創(chuàng)傷敷料、組織工程、藥物傳遞等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用;此外,因其具有高度微孔化結(jié)構(gòu),在用作藥物載體時,還可通過調(diào)節(jié)交聯(lián)率來控制藥物的釋放速率[1],故已被廣泛應(yīng)用于緩釋藥物傳遞系統(tǒng)及局部給藥系統(tǒng)如經(jīng)皮給藥、直腸及陰道給藥等[2]。
傳統(tǒng)的水凝膠易碎、機(jī)械性能差,不能承受高壓力及高應(yīng)力[3]。聚氨酯水凝膠作為一種聚氨酯材料,兼有聚氨酯與水凝膠兩者的優(yōu)點(diǎn),具有良好的機(jī)械性能[4]。目前,一種基于聚氨酯水凝膠的制劑地諾前列酮栓(商品名:欣普貝生)已上市,并以其良好的緩釋性能及臨床效果而在同類產(chǎn)品中脫穎而出,主導(dǎo)歐美市場。
克林霉素磷酸酯(clindamycin phosphate,CLP)為半合成的克林霉素衍生物,是一種高效的廣譜抗生素,對厭氧菌及革蘭陽性需氧菌具有較強(qiáng)的抗菌活性,臨床上可用于治療各類感染。其中,治療細(xì)菌性陰道炎時,CLP的傳統(tǒng)給藥劑型主要為陰道乳膏、陰道胚珠及口服制劑,但這些劑型均有一定的局限性,如:口服制劑存在胃腸道刺激、肝腎功能損傷等副作用;乳膏及胚珠可能會溢出給藥部位,導(dǎo)致給藥量不足且順應(yīng)性差[5]。為克服CLP傳統(tǒng)陰道劑型的局限,本文以聚乙二醇(PEG)、二環(huán)己基甲烷二異氰酸酯(DMDI)和1,2,6-己三醇(HT)為原料,采用一步法合成了聚氨酯水凝膠材料,通過傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析及溶脹率對其進(jìn)行了表征,制備了CLP陰道栓劑并探討了其體外釋放行為。
1.1 藥品及試劑
CLP(純度99%,鄭州興人化工產(chǎn)品有限公司);PEG6000(相對分子質(zhì)量為5 400~7 800,西隴化工股份有限公司);DMDI(日本TCI公司);HT (Acros Organics公司);無水氯化鐵(Alfa Aesar公司);乙腈(色譜純,國藥試劑);其他試劑均為市售分析純。
1.2 儀器
電子天平(德國賽多利斯公司);LC-2010A HT型色譜儀(日本島津公司);ZRS-8G型智能溶出試驗(yàn)儀(天津大學(xué)無線電廠);Nicolet2000型紅外光譜儀(美國Nicolet公司);KH5200DB型超聲波清洗器(江蘇昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。
2.1 聚氨酯水凝膠的合成與表征
2.1.1 聚氨酯水凝膠的合成 稱取PEG6000(9 g,按-OH計(jì),0.003 mol)置于三頸瓶,加入FeCl3(質(zhì)量約為PEG6000的0.1%),120℃加熱,攪拌熔融,抽真空除濕4 h以上;降溫至80℃,加入HT (0.201 2 g,按-OH計(jì),0.004 5 mol),真空除濕約30 min;快速加入DMDI(0.984 0 g,按-NCO計(jì),0.007 5 mol),攪拌約5 min,倒入85℃預(yù)熱的模具中,固化10 h,冷卻至室溫,得表面光滑、略帶黃色的薄板,避光防潮保存?zhèn)溆谩?/p>
2.1.2 傅里葉變換紅外光譜分析 取聚氨酯薄板磨成細(xì)粉后與KBr混勻壓成薄片,通過紅外光譜儀進(jìn)行測定。
2.1.3 溶脹率測定 將聚氨酯薄板待測樣品剪成質(zhì)量約為0.2 g的小片,置37℃的去離子水50 mL中。分別于5、10、20、30、60、90、120、180、240及360 min時,將樣品取出,用吸水紙擦干表面的水分,立即稱重。將樣品取出稱重過程中消耗的時間從溶脹時間中扣除,按公式1[6]計(jì)算溶脹率(S):
其中,wt表示t時刻樣品的質(zhì)量(g),w0表示樣品的初始質(zhì)量(g)。
2.2 克林霉素磷酸酯陰道栓劑的制備
2.2.1 栓劑的幾何形狀 將合成的聚氨酯薄板用裁刀切成幾何尺寸為29mm×9.5mm,厚度分別為0.8、1.3及1.6 mm的邊緣圓滑的空白栓劑(見圖1)。
圖1 栓劑的幾何形狀Figure 1 Geometric shape of the pessary
2.2.2 克林霉素磷酸酯栓劑的制備 將空白栓劑置適量水-乙醇(50∶50)混合溶劑中,充分溶脹純化12 h后于25℃下真空干燥24 h以上。
載藥方法:將一定量(目標(biāo)載藥量)的CLP溶于適量水-乙醇(50∶50)中,并將純化后的空白栓劑置于該溶液中,25℃下充分溶脹12 h,然后將載藥完畢的栓劑于25℃下真空干燥48 h以上。
2.2.3 栓劑藥物載藥量測定 取栓劑一枚,剪成小塊,置于250 mL量瓶中,加水適量,超聲60 min,放冷至室溫后,加水定容,搖勻,過0.45μm濾膜,取續(xù)濾液供液相分析。平行測定10枚。計(jì)算實(shí)際載藥量與目標(biāo)載藥量之比。
HPLC條件:色譜柱為Diamonsil C18柱(250 mm×4.6mm,5μm),流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖液(磷酸二氫鉀13.6 g溶于水1 000 mL中,磷酸調(diào)pH 2.5) (28∶72),柱溫為30℃,流速為1 mL·min-1,檢測波長為210 nm,進(jìn)樣量為20μL。
2.3 克林霉素磷酸酯栓劑的體外釋放度的測定
2.3.1 分析方法 HPLC方法同“2.2.3”項(xiàng)。以pH 4.5磷酸鹽緩沖液(磷酸二氫鉀6.8 g溶于水1 000 mL中,以磷酸調(diào)節(jié)pH至4.5)為溶劑,配制CLP溶液,考察液相色譜方法的線性范圍、精密度及回收率。
2.3.2 釋放條件 采用中國藥典(2010版)附錄ⅩC溶出度測定法中漿法進(jìn)行測定,釋放介質(zhì)為pH 4.5的磷酸鹽緩沖液500 mL,溫度為(37±0.5)℃,轉(zhuǎn)速為50 r·min-1。在5、10、20 min及0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8 h時,取樣1 mL,過0.45μm濾膜,取續(xù)濾液供液相分析,并同時補(bǔ)充釋放介質(zhì)1 mL。
2.4 影響栓劑體外釋放的因素考察
2.4.1 聚氨酯的化學(xué)組成對藥物釋放的影響 分別取PU/1.5HT(PEG6000中與HT中羥基的物質(zhì)的量比為1∶1.5,下面依此類推)、PU/2.0HT、PU/2.5HT及PU/3.0HT材料,切成厚度為1.6 mm的空白栓劑,制備成含CLP 50 mg的栓劑,并按“2.3.2”項(xiàng)下方法考察釋放行為,每個規(guī)格平行測定3份。
2.4.2 栓劑厚度對藥物釋放的影響 取PU/2.0HT材料,切成厚度分別為0.8、1.3及1.6 mm的空白栓劑,制備成含CLP 50 mg的栓劑,按“2.3.2”項(xiàng)下方法考察釋放行為,每個規(guī)格平行測定3份。
2.4.3 栓劑載藥量對藥物釋放的影響 取PU/ 2.0HT材料,切成厚度為1.6 mm的空白栓劑,制備成分別含CLP 25、50、75及100 mg的栓劑,按“2.3.2”項(xiàng)下方法考察釋放行為,每個規(guī)格平行測定3份。
2.4.4 pH對藥物釋放的影響 取PU/2.0HT材料,切成厚度為1.6 mm的空白栓劑,制備成含CLP 50 mg的栓劑,分別以pH 4.5、6.0及7.4的磷酸鹽緩沖液(磷酸二氫鉀6.8 g溶于水1 000 mL中,以0.5 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH)為釋放介質(zhì),按“2.3.2”項(xiàng)下方法考察釋放行為,每個規(guī)格平行測定3份。
2.5 克林霉素磷酸酯的體外釋放機(jī)制的探討
Ritger-Peppas方程[7](方程1)可用于分析溶脹型藥物載體系統(tǒng)的藥物釋放數(shù)據(jù),本文采用該方程對CLP體外釋放數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,以探討CLP的釋放機(jī)制。栓劑以 PU/2.0HT材料為基質(zhì),厚度為1.6 mm,載藥量為50 mg。
Rt表示t時刻藥物釋放百分?jǐn)?shù);k表示特定結(jié)構(gòu)或幾何形狀釋藥系統(tǒng)的釋放常數(shù);n表示釋放指數(shù)。
3.1 聚氨酯水凝膠的合成與表征
3.1.1 聚氨酯水凝膠材料的合成 本文在參考文獻(xiàn)[8]的基礎(chǔ)上,采用一步法合成不同化學(xué)組成的聚氨酯水凝膠材料(見表1),所得材料表面光滑,略帶黃色,具有良好的韌性。
表1 各組聚氨酯水凝膠材料的化學(xué)組成Table1 Chemical composition of polyurethane hydrogels
3.1.2 傅里葉變換紅外光譜分析 通過FTIR對聚氨酯材料的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性表征,一般主要參考2個波長區(qū)域:N-H伸縮振動(3 200~3 500 cm-1)和C==O伸縮振動(1 700~1 730 cm-1)[9-10](見圖2)。結(jié)果顯示:在2 250~2 270 cm-1范圍未見明顯的峰,表明聚合物中-NCO可忽略不計(jì),即反應(yīng)完全[11-12];在約1 714和1 112 cm-1處的伸縮振動峰(分別歸屬于-C==O和-C-O)表明酯鍵的形成,在3 422和1 531 cm-1處的伸縮振動峰顯示-NH-的形成,在1 243 cm-1的伸縮振動峰則歸屬于-C-N,以上信息證實(shí)了聚氨酯材料被成功合成。
圖2 聚氨酯材料的紅外光譜Figure 2 FTIR spectra of the polyurethanes
3.1.3 溶脹率測定 作為藥物緩釋載體材料,聚氨酯水凝膠的溶脹性能對控制藥物的釋放行為具有重要的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:各組成聚氨酯材料在6 h時達(dá)到溶脹平衡,在溶脹過程中,材料逐漸由半透明狀變成透明狀,表面光滑,質(zhì)地柔軟;從材料PU/1.5HT到PU/3.0HT,平衡溶脹率由494%降至243%,可見隨著交聯(lián)度的增加,溶脹率逐漸降低(見圖3),推測隨著聚氨酯交聯(lián)度的增大,溶脹后所形成的水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中,網(wǎng)格更加致密,吸水量減少。
圖3 聚氨酯水凝膠在37℃去離子水中的溶脹曲線(±s,n=3)Figure 3 Swelling profile of polyurethanes of different composition in deionized water at37℃
3.2 克林霉素磷酸酯栓劑的制備
制備的栓劑呈淡黃色,表面光滑,且能保持空白栓劑的幾何形狀。測得栓劑中CLP占目標(biāo)載藥量的95% ~105%,平均為103.0%,RSD為1.8% (n=10),表明該方法載藥效果良好。
3.3 克林霉素磷酸酯栓劑體外釋放行為及其影響因素
3.3.1 分析方法 在給定的色譜條件下樣品色譜峰分離度良好,理論塔板數(shù)不低于3 000,CLP溶液在10~200 mg·L-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r=0.999 9),精密度良好(RSD=0.5%,n=6),平均回收率為99.6%(RSD=0.9%,n=9)。
3.3.2 聚氨酯的化學(xué)組成對藥物釋放的影響 為模擬人體陰道環(huán)境,本文采用pH 4.5的磷酸鹽緩沖液作為體外釋放介質(zhì)[13],體外釋放結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示:各組栓劑的CLP釋放曲線幾乎重合,在0.5、1和4 h時,CLP的釋放百分?jǐn)?shù)分別約為40%、59%及96%,8 h釋放百分?jǐn)?shù)接近100%,表明栓劑具有一定的緩釋效果。由圖4可見,在一定化學(xué)組成范圍內(nèi),聚氨酯水凝膠對CLP的體外釋放基本無影響。
圖4 不同化學(xué)組成的聚氨酯水凝膠栓劑中克林霉素磷酸酯的釋放曲線(±s,n=3)Figure 4 Release curve of clindamycin phosphate from pessaries of different composition
3.3.3 栓劑厚度對體外釋放的影響 不同厚度栓劑中CLP的體外釋放曲線見圖5。結(jié)果顯示:隨著栓劑厚度的增加,CLP釋放速度變慢,0.5 h時,0.8、1.3和 1.6 mm組栓劑 CLP釋放百分?jǐn)?shù)依次為77%、42%和36%。提示當(dāng)栓劑厚度增加時,栓劑對CLP的緩釋作用更明顯;厚度過薄時,則會喪失對CLP的緩釋作用,因此,在設(shè)計(jì)栓劑時,可通過調(diào)節(jié)栓劑的厚度來控制釋藥速率。
圖5 不同厚度栓劑中克林霉素磷酸酯的釋放曲線(±s,n=3)Figure 5 Release curve of clindamycin phosphate from pessaries of different thickness
3.3.4 栓劑載藥量對體外釋放的影響 不同載藥量的栓劑體外釋放曲線見圖6。結(jié)果顯示:載藥量對CLP體外釋放基本沒有影響。在0.5、1和4 h時,不同載藥量的栓劑中CLP的釋放百分?jǐn)?shù)分別約為36%、58%和95%,8 h時基本釋放完全。
3.3.5 pH對藥物釋放的影響 栓劑中CLP在pH分別為4.5、6.0和7.4的磷酸鹽緩沖液中的體外釋放曲線見圖7。結(jié)果顯示:pH由4.5升至6.0,CLP的釋放基本沒有變化;而當(dāng)pH升至7.4時,釋放有所減緩,其1、2和6 h釋放百分?jǐn)?shù)分別比pH 4.5時降低了9%、11%和6%,緩釋效果更佳。
圖6 不同載藥量的栓劑中克林霉素磷酸酯的釋放曲線(±s,n=3)Figure 6 Release curve of clindamycin phosphate from pessaries of different drug loading
圖7 不同pH條件下栓劑中克林霉素磷酸酯的釋放曲線(±s,n=3)Figure 7 Release curve of clindamycin phosphate from pessaries in different releasemedia
3.4 克林霉素磷酸酯的體外釋放機(jī)制 CLP栓劑在pH分別為4.5、6.0和7.4的釋放介質(zhì)中的體外釋放數(shù)據(jù)的擬合結(jié)果見表2。由表2可知,擬合方程中n介于0.61~0.68,表明CLP釋放為非Fick擴(kuò)散,由溶脹及擴(kuò)散雙重機(jī)制控制。
表2 不同pH條件下栓劑中克林霉素磷酸酯體外釋放數(shù)據(jù)的擬合方程Table2 The fitting equation of in vitro release data of CLP under different pH conditions
4.1 聚氨酯水凝膠的合成與表征
聚氨酯合成的方法有半預(yù)聚體法、預(yù)聚體法和一步法,其中,一步法因具有操作簡便、成本低的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。本文亦采用該法合成聚氨酯水凝膠材料。
合成聚氨酯材料時,投料比一般按照原料DMDI中異氰酸根(-NCO)的物質(zhì)的量與PEG6000和HT中-OH的物質(zhì)的量之和相等的原則。-NCO與-OH反應(yīng)后生成氨基甲酸酯基團(tuán)(-NH-COO-),形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(見圖8)。當(dāng)原料中-NCO的物質(zhì)的量大于-OH的物質(zhì)的量時,多余的-NCO會與生成的氨基甲酸酯反應(yīng),生成副產(chǎn)物脲基甲酸酯[14];當(dāng)-OH的物質(zhì)的量過量時,則無法形成完整的聚氨酯水凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),尤其是-OH大大過量時,最終產(chǎn)物會呈現(xiàn)PEG的特點(diǎn),導(dǎo)致材料的脆性較大。
圖8 聚氨酯水凝膠的合成示意圖Figure 8 Reaction scheme of polyurethane hydrogel
DMDI與PEG、HT發(fā)生反應(yīng)的活性不高,不加FeCl3幾乎不反應(yīng)。經(jīng)過優(yōu)化,確定FeCl3的加入量為PEG6000的0.1%,這樣既可保證反應(yīng)時間不會過長,又能確保操作過程中反應(yīng)混合物不會凝膠化而影響操作。
目前,聚氨酯材料的確證方法主要有NMR及FTIR等,前者只適用于線型聚氨酯材料,后者則適用于線型及體型聚氨酯材料。本文合成的材料為體型聚氨酯材料,故采用FTIR對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。FTIR圖譜顯示:-NCO基團(tuán)特征峰消失,-NH-COO特征峰產(chǎn)生,從而確證了聚氨酯水凝膠材料合成成功。一般來說,聚氨酯材料中羰基的游離態(tài)吸收峰在1 730 cm-1左右,羰基氫鍵化后吸收峰則降低至1 710 cm-1左右,故可認(rèn)為本文合成的聚氨酯材料中有一部分羰基參與了氫鍵化作用[15]。
本文合成的水凝膠材料具有良好的生物相容性[16],雖然尚需對其純度及人體安全性作進(jìn)一步的評價,但已為其應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供了良好的基礎(chǔ)。
4.2 CLP栓劑的制備
常見的陰道栓劑有球形、卵形、鴨嘴形等形狀。其幾何形狀可根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié),本文參考了市售制劑欣普貝生的幾何形狀(29mm×9.5mm×0.8mm)。
本實(shí)驗(yàn)中,載藥前通過水-乙醇(50∶50)對空白栓劑進(jìn)行純化以除去可溶性雜質(zhì)(如未反應(yīng)的PEG6 000及HT)。純化并干燥后,空白栓劑能恢復(fù)原有的幾何形狀,失重率僅約為1.5%,既保證了栓劑的質(zhì)量又不至于影響其載藥性能。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)中采用的制備方法載藥效果良好,操作方便,可控性強(qiáng),具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
4.3 克林霉素磷酸酯栓劑體外釋放行為
健康女性陰道pH介于3.8~4.5,而細(xì)菌性陰道炎患者陰道中的pH會升高,嚴(yán)重者pH可接近7,故有必要考察CLP栓劑在不同pH環(huán)境下的釋放行為。本文綜合考慮影響栓劑釋放的制劑學(xué)性質(zhì)及生理因素,考察了化學(xué)組成、栓劑厚度、栓劑載藥量及釋放介質(zhì)的pH對CLP體外釋放行為的影響,并探討了其釋放機(jī)制。結(jié)果顯示:CLP的體外釋放受栓劑厚度及pH的影響,而栓劑的化學(xué)組成及載藥量對其基本無影響。其中,栓劑厚度對釋放的影響可能是由于厚度的不同導(dǎo)致了比表面積的不同,厚度增加,比表面積減少,釋放減緩。pH對釋放的影響則可能是因不同解離狀態(tài)的CLP在聚氨酯水凝膠中的擴(kuò)散速率不同所導(dǎo)致[17]。CLP的解離常數(shù)(p Ka)為7.5[18],根據(jù) Handerson-Hasselbach方程,當(dāng)pH為4.5及6.0時,CLP幾乎全部處于解離狀態(tài),而當(dāng)pH為7.4時,CLP僅約有一半處于解離狀態(tài)。這種解離狀態(tài)的不同可能最終導(dǎo)致釋放速率略微不同。對于細(xì)菌性陰道炎患者來說,陰道內(nèi)pH的升高可能會帶來更好的緩釋效果,使栓劑在體內(nèi)持續(xù)釋放出藥物,維持局部較高的藥物濃度,從而發(fā)揮良好的殺菌作用。
對于完全溶脹水凝膠,其藥物釋放一般遵循Fick擴(kuò)散[8]。本實(shí)驗(yàn)制備的水凝膠栓劑則首先需吸水溶脹,溶解栓劑中的藥物,隨后才進(jìn)行藥物釋放,因此,其控釋藥物的機(jī)制并非簡單的Fick擴(kuò)散。Ritger-Peppas方程中,對于片狀釋藥系統(tǒng)來說,當(dāng)n=0.5時,顯示藥物釋放符合Fick擴(kuò)散,為擴(kuò)散控制型釋放;當(dāng)n=1.0時,顯示藥物釋放為溶脹控制型;當(dāng)0.5<n<1.0時,則說明藥物釋放非Fick擴(kuò)散,由溶脹及擴(kuò)散雙重機(jī)制控制。擬合結(jié)果證實(shí),栓劑在pH4.5、6.0及7.4時均為非Fick擴(kuò)散,由溶脹及擴(kuò)散雙重機(jī)制控制。
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