呂艷，薛向陽，林茂，王冰冰，李寶青，王志斌，張麗芳

（1.溫州醫(yī)學院 微生物學和免疫學教研室，傳染病與疫苗研究所，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院 檢驗科，浙江 溫州 325027）

miR-133a在急性髓系細胞白血病中的表達及意義

呂艷1，薛向陽1，林茂1，王冰冰1，李寶青2，王志斌1，張麗芳1

（1.溫州醫(yī)學院 微生物學和免疫學教研室，傳染病與疫苗研究所，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院 檢驗科，浙江 溫州 325027）

目的：探討miR-133a在急性髓系細胞白血?。ˋML）骨髓有核細胞中的表達及意義。方法：收集37例AML初診患者及25例化療后完全緩解患者、12例急性淋巴細胞白血病（ALL）初診患者和22例骨髓象正常的發(fā)熱患者的骨髓標本。分離有核細胞，抽提總RNA，以U6為內參，采用實時熒光定量莖環(huán)RTPCR檢測并比較AML、ALL及骨髓象正常的非白血病患者骨髓有核細胞中miR-133a的表達，同時比較miR-133a在AML常見亞型及化療緩解前后的表達水平。結果：miR-133a在AML初診患者骨髓中相對表達量（N=2-△Ct）明顯高于ALL和非白血病患者（P＜0.05）；M3、M4及M5三種常見AML類型中，M5患者的骨髓標本miR-133a表達明顯高于M3患者（P＜0.05）；AML化療完全緩解后骨髓有核細胞中miR-133a的表達較化療前明顯下降（P＜0.05）。結論：miR-133a可能參與AML的發(fā)生發(fā)展進程，其骨髓表達水平可為化療敏感性評價提供一個新的指標。

微小RNA；微小RNA133a；白血病，髓樣，急性

MicroRNA（miRNA）是長度約22 nt的內源性短鏈RNA，它通過和編碼蛋白質的mRNA互補結合，沉默其表達，從而起到調控細胞的分化、生長、發(fā)育、增殖、代謝、凋亡等功能[1-4]，并可作為腫瘤抑制或促進因子參與腫瘤的發(fā)生過程[5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-133a在腫瘤組織中存在明顯差異表達，可能參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6-8]。但miR-133a與白血病的關系少有研究。本研究通過莖環(huán)RT-實時定量PCR方法檢測急性髓系細胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）、急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）及非白血?。╪one leukemia，NL）患者骨髓有核細胞中miR-133a的表達水平，分析AML中常見的M3型、M4型和M5型之間miR-133a表達的差異及化療緩解前后的變化，探討miR-133a在AML中的表達情況及其臨床意義。

1 對象和方法

1.1 研究對象 2008年10月至2009年7月，選擇溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院血液腫瘤科確診的37例AML患者（年齡27～65歲，中位年齡41歲）的初診骨髓，包括2例M2型、7例M3型、15例M4型、12例M5型及1例M7型。AML化療后完全緩解患者25例（年齡32～73歲，中位年齡42歲）的骨髓，包括2例M2型、5例M3型、10例M4型及8例M5型。ALL初診骨髓標本12例，包括6例ALL1和6例ALL2，年齡16～58歲，中位年齡38歲。選擇22例骨髓象正常的發(fā)熱患者作為NL骨髓對照，年齡18～75歲，中位年齡42歲。骨髓標本經紅細胞裂解液處理后，加Trizol（購自Invitrogen公司）徹底溶解，-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 RNA抽提：按Trizol試劑說明書抽提樣品總RNA，為增加小RNA得率，異丙醇沉淀步驟改為-20 ℃沉淀2 h以上。焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）處理水溶解RNA，分光光度計測定260 nm及280 nm吸光值，確定RNA溶液濃度和純度。取2～5μg總RNA以1%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.2.2 miR-133a表達分析：參照文獻[9-11]的實時熒光定量莖環(huán)RT-PCR miRNA檢測方法，以U6為內參分析miR-133a表達。PCR所用引物由上海英駿生物技術有限公司合成，其序列見表1。1μg總RNA以miR-133a莖環(huán)RT引物進行逆轉錄。為準備實時熒光定量PCR內參模板cDNA，用相同的總RNA標本以U6 RT引物為逆轉錄引物進行逆轉錄。逆轉錄反應體系為1μg總RNA、50 nmol/L miR-133a莖環(huán)RT引物（或U6 RT引物）、2 U RNase inhibitor、5 U M-MLV逆轉錄酶、0.5 μmol/L dNTP。反應條件為：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，75 ℃ 15 min，反應結束后-20 ℃保存。以15μL反應體系進行實時熒光定量PCR。實時熒光定量PCR檢測反應體系包括：1μL RT產物，1×SYBR Green I Mastermix，0.5μmol/L miRNA特異前向引物、0.5μmol/L通用的反向引物。實時熒光定量PCR條件為：95 ℃ 10 min后，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40循環(huán)。實時熒光定量PCR使用Applied Biosystems 7500儀器進行。所有樣品做3復孔。PCR產物經8% PAGE電泳分析。記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的域值時所經歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，以U6作為內參照，采用定量PCR中的相對定量法，以N=2-△Ct表示目的基因的表達相對于內參的變化倍數(shù)，其中△Ct=CtmiRNACtU6。為增加數(shù)據(jù)直觀性，所有數(shù)據(jù)均放大103倍。1.3 統(tǒng)計學處理方法 miRNA表達數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件的非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗（兩組）和Kruskal-Wallis H檢驗（多組）進行統(tǒng)計處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-133a在AML、ALL初診患者及NL患者骨髓有核細胞中的表達 如圖1所示，miR-133a及U6的實時熒光定量PCR產物溶解曲線均為單峰，8% PAGE電泳顯示PCR產物為單一條帶（見圖1下），說明莖環(huán)RT-PCR能特異擴增相應的miRNA。以U6為內參，miR-133a在AML初診患者骨髓中相對表達量（N=2-△Ct）為1.35（0.73，3.89），在ALL初診患者骨髓中相對表達量為0.12（0.09，0.21），在NL患者骨髓中相對表達量為0.41（0.23，0.56），經檢驗，miR-133a在AML初診患者骨髓中的表達明顯高于ALL和NL患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2。2.2miR-133a在3種AML亞型骨髓有核細胞中的表達 如圖3所示，miR-133a在M3、M4及M5患者的骨髓標本表達分別為0.83（0.65，1.16）、1.64（0.76，5.02）及2.93（1.33，4.60）。統(tǒng)計分析顯示，M4患者和M3及M5患者miR-133a表達差異無統(tǒng)計學意義（P分別為0.130和0.696），但miR-133a在M3和M5患者中的表達差異有統(tǒng)計學意義（P=0.022）。

2.3 miR-133a在AML化療緩解前后骨髓有核細胞中的表達 如圖4所示，AML化療完全緩解后骨髓有核細胞中miR-133a的表達明顯下降（P=0.004），表達中位數(shù)從初診的1.35降低到化療后的0.49。

圖1 miR-133a及U6內參實時熒光定量PCR溶解曲線和PCR產物8% PAGE電泳

圖2 miR-133a在AML、ALL初診患者及NL患者骨髓有核細胞中的表達

圖3 3種AML亞型骨髓有核細胞中miR-133a的表達水平

3 討論

與其他腫瘤一樣，AML的發(fā)生發(fā)展也是一個多基因改變的過程。以往的研究大多集中在編碼蛋白的癌基因或抑癌基因上，近年來新發(fā)現(xiàn)的一類內源性微小RNA，即miRNA，它不編碼蛋白質，通過堿基配對決定mRNAs的翻譯和穩(wěn)定性，從而調控細胞的分化、生長、發(fā)育、增殖、代謝、凋亡等功能[2]。miRNA可以通過其存在、缺失和表達水平的改變影響造血細胞譜系的選擇和分化[22]，參與血液腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[12-18，21，24]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的失調表達與AML患者細胞遺傳學及治療結果有關，高表達的miR-191和miR-199a跟生存期短及無病生存率低有顯著的關系[19]。

miR-133a是肌肉組織特異性miRNA，在控制心臟發(fā)育中起重要作用[20]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-133a可作為抑癌基因參與膀胱癌和食管癌的發(fā)生發(fā)展[6-7]。迄今，miR-133a在白血病患者中的表達及作用鮮見研究報道。為此，本研究選擇患者骨髓有核細胞進行分析。以U6為內參，應用實時熒光定量莖環(huán)RT-PCR技術首先檢測了AML、ALL初診患者及骨髓象正常的發(fā)熱患者骨髓有核細胞miR-133a的表達，結果顯示miR-133a在AML中明顯高表達。由于AML和ALL的預后不同，因此有效區(qū)分AML和ALL將有助于臨床的治療。Mi等[23]報道在AML和ALL中表達差異最顯著的4個miRNAs是miR-128a、miR-128b、let-17b和miR-223，而其中任意兩個miRNA都可以準確、有效地區(qū)分97%～100%的AML和ALL患者，這為臨床AML和ALL的分類和診斷提供了新的標記。我們通過比較發(fā)現(xiàn)，AML的miR-133a表達水平遠高于ALL，提示miR-133a或許可以輔助性地作為AML和ALL分類和診斷的標記物。

本研究分析所選擇的M3、M4、M5三種常見的AML型別間miR-133a表達，結果顯示，miR-133a表達在M3（急性早幼粒細胞白血?。┘癕5（急性單核細胞白血?。┐嬖陲@著差異。進一步分析化療緩解前后miR-133a表達的變化，結果顯示化療緩解后miR-133a的表達明顯下調，提示miR-133a可能類似癌基因參與AML發(fā)生發(fā)展進程?；熕幬锟刹糠种苯踊蜷g接通過調節(jié)miR-133a的表達，但由于標本量較少，我們的實驗數(shù)據(jù)尚無法說明這種下調的程度是否與患者的預后有關，還需更大的標本做隨訪性研究。

綜上所述，本研究表明，miR-133a在AML患者的骨髓有核細胞中表達明顯上調，不同類型的AML表達存在差異，且經化療緩解后miR-133a的表達下調，提示，miR-133a可能參與AML的發(fā)生發(fā)展進程，其骨髓表達水平可為化療敏感性評價提供一個新的指標。

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Expression and significance of miR-133a in acute myeloid leukemia

LV Yan*，XUE Xiangyang，LIN Mao，WANG Bingbing，LI Baoqing，WANG Zhibing，ZHANG Lifang.
*Department of Medical Microbiology and Immunology，Institute of Molecular Virology and Immunology，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Objective:To probe the expression and clinical significance of miR-133a in the marrow of acute myeloid leukemia(AML).Methods:Marrow tissues from 37 AML patients before chemotherapy，25 AML patients with complete remission(CR)after chemotherapy， 12 acute lymphoblastic leukemia(ALL)patients before chemotherapy and 22 non-leukemia(NL) fever patients with normal bone marrow picture were collected. Total RNA from nucleated cells of these samples were extracted and analyzed for miR-133a expression by stem-loop RT real-time-PCR based on the SYBR Green I. The differences in M3，M4 and M5 patients and the change of miR-133a expression in before- and after-chemotherapy AML patients were further analyzed.Results:Expression levels of miR-133a were significantly higher in marrow tissues of AML patients before chemotherapy than that in those of all patients before chemotherapy and nonleukemia patients(P＜0.05). The expression of miR-133a in the marrow tissues of M5-type patients was significantly higher than that in M3-type AML(P＜0.05). Compared to beforechemotherapy patients，the expression levels of miR-133a in the AML patients with complete remission(CR)after chemotherapy decreased significantly(P＜0.05).Conclusion:MiR-133a may play an important role in the development and progression of AML and the level of miR-133a expression may be a potential biomarker for the sensitivity of AML treatment.

microRNA；miR-133a；leukemia，myeloid，acute

R733.71

A

1000-2138（2012）06-0517-05

2012-03-21

浙江省教育廳科研基金資助項目（Y200907403）；溫州市科技局科研基金資助項目（Y20090103）。

呂艷（1985-），女，安徽宿州人，碩士生。

張麗芳，教授，博士生導師，Email：wenzhouzlf@126.com。

丁敏嬌）

·論 著·