周麗麗，胡北，崔勝云

（延邊大學(xué)長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室，吉林 延吉133002）

熒光光譜法測定啤酒中核黃素的含量

周麗麗，胡北，崔勝云＊

（延邊大學(xué)長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室，吉林 延吉133002）

探討了酸度和光降解作用對核黃素吸收和熒光光譜的影響.利用改進(jìn)后的熒光光譜法測定了不同品牌啤酒樣品中游離核黃素的含量，結(jié)果表明，所選啤酒樣品中的核黃素含量在0.025 97～0.034 29μg／mL范圍內(nèi).該方法操作簡單、結(jié)果可靠，為定量測定基體復(fù)雜樣品中的核黃素含量提供了新的方法.

核黃素；熒光光譜法；紫外可見光譜法；熒光猝滅

0 引言

核黃素不能在人體內(nèi)自合成，只能從食物和外源性補充劑中攝取，因此，對食品和藥物中核黃素含量的測定具有重要的實際意義.目前，測定核黃素的方法較多，如紫外分光光度法［1］、電化學(xué)法［2］、高效液相色譜法［3］、毛細(xì)管電泳法［4］、熒光光譜法等，其中熒光光譜法因具有靈敏度高、選擇性好等特點而被廣泛應(yīng)用.但在實際樣品的測定中由于該方法易受到基體干擾，故需要分離干擾成分等前處理過程，使得分析操作變得繁雜、耗時.根據(jù)文獻(xiàn)［5－7］報道，連二亞硫酸鈉在440～500 nm激發(fā)光下，對核黃素產(chǎn)生的綠色熒光具有選擇性猝滅作用.鑒于此，本文利用連二亞硫酸鈉對核黃素的熒光猝滅作用，即利用猝滅前后熒光強度之差消除樣品中熒光的干擾，測定了啤酒中的核黃素含量.

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

RF－5301熒光分光光度儀（島津公司），UV－8500紫外分光光度儀（天美公司），p HS－3C型實驗室酸度計.核黃素（Sigma公司），其他試劑皆為分析純試劑，實驗用水為2次蒸餾水.

1.2 核黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備

準(zhǔn)確稱取0.003 8 g經(jīng)干燥的核黃素粉狀結(jié)晶，置于100 mL容量瓶，加入p H＝4.5的醋酸－醋

酸鈉緩沖液.將容量瓶置于溫水中搖動，溶解后冷卻至室溫，然后移至棕色瓶內(nèi)，加少許甲苯蓋于溶液表面，放置于冰箱中保存.使用時，用醋酸－醋酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)溶液的p H值并稀釋至測定濃度.

1.3 樣品的處理測定

準(zhǔn)確量取2 m L不同品牌的瓶裝啤酒樣品，加入p H＝4.5的醋酸－醋酸鈉緩沖液8 m L，然后用定量濾紙進(jìn)行減壓過濾，再取一定量的濾液放入棕色容量瓶中稀釋至刻度作為待測液.

1.4 操作步驟

于激發(fā)波長470 nm、發(fā)射波長527 nm處測定待測液的熒光強度F0，然后加入2 mg連二亞硫酸鈉后再測定其熒光強度F1.待測液中核黃素的熒光發(fā)射強度If＝（F0－F1），啤酒樣品中核黃素的含量，其中C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程If＝8.993＋34.612C算得的待測液中核黃素的濃度（mol／L），V1為用醋酸 －醋酸鈉緩沖液定容的試樣體積（0.01 L），V2為樣品的體積（2 mL），M為核黃素的相對分子量.

2 結(jié)果和討論

2.1 酸度對核黃素吸收和熒光光譜的影響

Hegemann等［8］研究核黃素的吸收和熒光特性時發(fā)現(xiàn)，溶液的酸度對核黃素的吸收和熒光特性具有明顯的影響.這是因為核黃素在不同酸度下具有一定的平衡（如圖1所示），即在0.2～9.75 p H值范圍內(nèi)是以中性態(tài)（RFIoxH）的形式存在，而在強酸和強堿性溶液中，分別是以陽離子態(tài)（RFIoxH＋2）和陰離子態(tài)（RFI－ox）的形式存在.

圖1 不同酸度下核黃素的中性態(tài)、陽離子態(tài)和陰離子態(tài)結(jié)構(gòu)圖

為探討不同酸度下核黃素的光譜性質(zhì)，配制不同酸度的核黃素溶液分別測定了Uv－vis吸收光譜和熒光光譜（見圖2）.圖2 A－C的結(jié)果表明：核黃素在不同酸度下的Uv－vis吸收光譜都出現(xiàn)了4個明顯的吸收峰，其中E帶和B帶的2個吸收峰是由于苯環(huán)的共軛結(jié)構(gòu)引起的，λmax＝351～373 nm的吸收峰是n→π＊電子躍遷所致，而λmax＝443 nm的吸收峰是π→π＊電子躍遷的結(jié)果.在可見區(qū)443 nm處，核黃素在HAc－Na Ac緩沖溶液中的中性態(tài)（RFIoxH）的吸收強度最強，在強酸性溶液（HCl）中的陽離子態(tài)（RFIoxH＋2）的吸收強度次之，在強堿性溶液（NaOH）中的陰離子態(tài)（RFI－ox）的吸收強度最弱.這一結(jié)果說明，強酸或強堿溶液中的離子態(tài)核黃素與中性態(tài)的核黃素相比其分子軌道特性和躍遷概率都會發(fā)生變化，從而導(dǎo)致光譜特性發(fā)生改變.圖2 A′－C′表明，熒光光譜受酸度的影響更加明顯.在激發(fā)波長為470 nm時，中性態(tài)核黃素的電子密度最大，所以其在527 nm處發(fā)射的熒光強度最強；而堿性下陰離子態(tài)核黃素的電子密度最小，所以幾乎無熒光發(fā)射.這可能是由于不同狀態(tài)下核黃素的分子軌道的電子密度不同而引起軌道能量和躍遷幾率發(fā)生變化并導(dǎo)致了不同的熒光猝滅作用.

2.2 光降解作用對核黃素吸收和熒光光譜的影響

核黃素在光照下容易發(fā)生光解，為探討光照對核黃素光譜特性的影響，在HAc－NaAc緩沖溶液中，用Uv－vis分光光度法和熒光分光光度法分別測定了光照（白熾燈）前后的光譜圖，結(jié)果見圖3.

由圖3A－B可以看出：苯環(huán)E帶和B帶的峰型在光照前后沒有發(fā)生明顯的變化，說明光照可能對核黃素的苯環(huán)結(jié)構(gòu)并不發(fā)生明顯的分解作用.在λmax＝373 nm和λmax＝443 nm處的吸收光譜帶發(fā)生明顯的藍(lán)移，且分別在λmax＝353 nm和λmax＝382 nm處出現(xiàn)新的吸收峰和吸收肩峰，但在波長443 nm以上幾乎沒有吸收峰.這一結(jié)果說明，光照導(dǎo)致了核黃素的分解，并且使其苯環(huán)以外的環(huán)外共軛結(jié)構(gòu)受到了破壞.由圖3 C－D可以看出，光降解后發(fā)射的熒光強度大大降低，說明光降解產(chǎn)物幾乎無熒光發(fā)射.因此用熒光分光光度法測定核黃素含量時，溶液必須得新鮮配制并避光保存，以免光降解作用導(dǎo)致測定的準(zhǔn)確度下降.

圖2 核黃素的紫外光譜圖（A－C）和熒光光譜圖（A′－C′）：A，A′為0.1 mol／L HCl；B，B′為0.1 mol／L HAc－NaAc溶液；C，C′為0.1 mol／L NaOH溶液；熒光測定激發(fā)波長λex＝470 nm

圖3 核黃素的紫外吸收光譜（A，B）和熒光光譜（C，D）：A和（1）為光解前；B和（2）為光解3 d后

2.3 熒光分光光度法測定啤酒中的核黃素含量

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取新鮮配制的標(biāo)準(zhǔn)核黃素溶液，測定不同濃度下核黃素溶液的熒光光譜圖，并繪制熒光發(fā)射強度與核黃素濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線（激發(fā)波長為470 nm），結(jié)果見圖4.圖4顯示，熒光強度與核黃素濃度之間呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為：If＝8.993＋34.612C，相關(guān)系數(shù)γ＝0.998 88.

圖4 核黃素的熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程

2.3.2 連二亞硫酸鈉對核黃素的熒光猝滅作用

取一定濃度的核黃素溶液，分別加入不同質(zhì)量的連二亞硫酸鈉（粉末狀）并測定其熒光光譜，結(jié)果見圖5.圖5顯示，隨著加入連二亞硫酸鈉質(zhì)量的增加，熒光發(fā)射強度明顯降低，當(dāng)加入量超過2 mg時，熒光發(fā)射完全猝滅.因此，本實驗中連二亞硫酸鈉的用量選定為2 mg.

2.3.3 啤酒中核黃素含量的測定 分別選擇6種不同的啤酒樣品，測定加入連二亞硫酸鈉前后的熒光光譜，結(jié)果見圖6.

圖6顯示，在熒光發(fā)射光譜圖中，所有啤酒樣品在527 nm處均有核黃素的特征峰.加入2 mg連二亞硫酸鈉后，核黃素的熒光猝滅作用使熒光強度大大降低，但在527 nm處仍有一定強度的熒光發(fā)射，說明啤酒樣品中仍存在黃素蛋白等干擾成分.根據(jù)加入連二亞硫酸鈉前后熒光強度的變化計算啤酒樣品中核黃素的含量，結(jié)果見表1.

圖5 激發(fā)波長為470 nm時，1×10－6 mol／L核黃素在HAc－NaAc緩沖溶液中的熒光發(fā)射光譜（1）和在樣品中分別加入0.8、1.2、1.6、2、2.4 mg連二亞硫酸鈉時的熒光光譜圖（2）－（6）

圖6 樣品中加入連二亞硫酸鈉前后的熒光發(fā)射光譜圖：（A，A′）、（B，B′）、（C，C′）分別為同一廠家不同品牌的啤酒樣品

表1表明，啤酒中核黃素的含量在0.025 97～0.034 29μg／m L范圍內(nèi).不同廠家啤酒產(chǎn)品中的核黃素含量雖有一些差別，但同一廠家不同品牌（發(fā)酵時間不同）的含量差別不大，說明啤酒中的核黃素含量與廠家所用原料中核黃素含量有關(guān)，而與發(fā)酵時間的長短關(guān)系不大.

表1 啤酒樣品中的核黃素含量

2.3.4 干擾和回收率 對100倍抗壞血酸、50倍尿酸、100倍半胱氨酸等進(jìn)行了干擾實驗.結(jié)果表明加標(biāo)回收率在93.98%～106.45%，基本滿足分析測定的要求.

3 結(jié)論

研究表明，酸度對核黃素的紫外光譜和熒光發(fā)射光譜有一定的影響，這與不同酸度下核黃素以不同的形態(tài)存在有關(guān).中性態(tài)核黃素的吸收和熒光特性最好，這可能是因為在強酸或強堿中，離子態(tài)的核黃素會改變分子軌道的能量狀態(tài)，導(dǎo)致躍遷概率降低或系間穿越增多，從而使熒光強度減弱.利用連二亞硫酸鈉對核黃素的熒光猝滅作用，測定了不同品牌啤酒樣品中游離核黃素的含量，結(jié)果表明，本方法操作簡便、結(jié)果可靠，為定量測定基體復(fù)雜樣品中的核黃素含量提供了新的方法.

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Riboflavin analysis in beer using fluorescence spectrometry

ZHOU Li－li，HU Bei，CUI Sheng－yun＊
（KeyLaboratoryofNaturalResourcesoftheChangbaiMountain＆Functional Molecules（YanbianUniversity），MinistryofEducation，Yanji133002，China）

Uv－vis spectrometric and fluorometric properties of riboflavin are investigated in different acidity and light degradation.A modified fluorescence method is used to detect the content of riboflavin in different brands of beer.The results indicated that the content of riboflavin in beers ranges from 0.025 97－0.034 29μg／m L.The method effectively eliminates metrix interferences and applicable to determination complex matrix samples.

riboflavin；fluorescence spectrometry；Uv－vis spectrometry；fluorescence quenching

O656.3

A

1004－4353（2012）01－0078－05

2012－03－05

＊通信作者：崔勝云（1957—），男，教授，研究方向為生物有機分析.