吳文斌，張超超，湯家銘

(上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心，上海201203)

微核試驗和彗星試驗檢測雄黃的遺傳毒性

吳文斌，張超超，湯家銘

(上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心，上海201203)

目的用短期給藥(小鼠骨髓細胞微核試驗和彗星試驗)和長期給藥(利用生殖毒性Ⅰ段試驗的大鼠做微核試驗和彗星試驗)檢測雄黃的遺傳毒性，探討利用長期毒性試驗或生殖毒性Ⅰ段試驗用動物進行遺傳毒性檢測的可行性。方法小鼠ig給予雄黃0.25，0.5和1.0 g·kg－1，每天1次，2 d后，取骨髓細胞做微核試驗和彗星試驗;利用生殖毒性Ⅰ段大鼠ig給予0.125，0.25和0.55 g·kg－1，雄性連續(xù)給藥42 d以上，交配成功后處死;雌性連續(xù)ig給藥19 d以上，妊娠第15天，取骨髓細胞做微核試驗和彗星試驗，取血做外周血淋巴細胞微核試驗。結果與陰性對照組比較，小鼠雄黃0.25，0.5和1.0 g·kg－1組微核試驗微核率分別為3.0‰，4.40‰，7.01‰(P＜0.05，P＜0.01)和彗星試驗拖尾率分別為6.3%，9.7%和11.3%(P＜0.05，P＜0.01)。與陰性對照組比較，生殖毒性Ⅰ段試驗大鼠ig給予雄黃，雄黃0.55 g·kg－1組雄性大鼠的骨髓微核和外周血淋巴細胞微核率分別為2.83‰和6.67‰(P＜0.05)，雌性大鼠0.25和0.55 g·kg－1的骨髓微核和外周血淋巴細胞微核率分別為1.5‰，2.25‰以及2.58‰和4.40‰(P＜0.05，P＜0.01);雄黃使雄性和雌性大鼠彗星拖尾率明顯升高(P＜0.05)。結論利用生殖毒性Ⅰ段試驗多次給藥后取材做微核試驗和彗星試驗方法可行;外周血微核試驗簡便易行;在所觀察的劑量下雄黃具有遺傳毒性。

雄黃;微核試驗;彗星試驗;誘變力試驗

雄黃(realgar)是礦物類中藥，主要成分為三硫化二砷(As2S3)?，F(xiàn)代藥理學研究表明，雄黃具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痙、止痛、殺蟲和抗菌等作用［1］。長期以來中醫(yī)認為雄黃有毒，內(nèi)服宜慎，不可久用，孕婦禁用，因此雄黃一直作為有毒中藥受到藥監(jiān)部門的嚴格控制。雄黃含有對人體有害元素砷，臨床上亦有過量服用而中毒的報道［2］。對雄黃的毒理學研究發(fā)現(xiàn)，雄黃具有肝腎毒性和細胞毒性［3－5］。但是否具有遺傳毒性報道不多，為此本研究采用小鼠骨髓細胞微核試驗和雄黃生殖毒性Ⅰ段試驗的大鼠處死時取材用微核試驗(micronucleus test，MT)和彗星試驗(comet assay，CA)對雄黃進行遺傳毒性研究。

1 材料與方法

1.1 動物

ICR小鼠，清潔級，體質(zhì)量35～38 g。利用生殖毒性Ⅰ段試驗SD大鼠，體質(zhì)量雄性426～498 g，雌性310～382 g。以上動物均由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物許可證號:SCXK(滬)2007-0005。溫度控制在20～25℃，濕度控制在40%～70%。動物自由攝食，飲水，1周換1～2次墊料。

1.2 藥物、試劑和儀器

雄黃，產(chǎn)地貴州，由上海封浜中藥飲片廠加工炮制成飲片為橙黃色細粉末，批號:H2007052401，經(jīng)上海市食品藥品檢驗所檢驗，三硫化二砷含量為95.5%。羧甲纖維素鈉(CMC-Na)，批號:F20090508，購自國藥集團化學試劑有限公司;環(huán)磷酰胺，批號:9J596A，購自Endoxan公司;低熔點和正常熔點瓊脂糖、吖啶橙、Giemsa染液及其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

DYY-6C型雙穩(wěn)定時電泳儀，北京六一儀器廠;Motic BA400生物顯微鏡，帶數(shù)碼照相及圖像分析系統(tǒng)，麥克奧迪實業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組和給藥

微核試驗ICR小鼠，按體質(zhì)量進行分層隨機分組，分成正常對照組、環(huán)磷酰胺陽性對照組、雄黃0.25，0.5和1.0 g·kg－1組，每組6只，給藥前禁食6 h。雄黃組按20 ml·kg－1ig給藥，陰性對照組ig給予等容量的0.5%CMC-Na，間隔24 h再次給藥。環(huán)磷酰胺按16 ml·kg－1給藥1次。ICR小鼠的雄黃0.125，0.25和0.55 g·kg－1組和陰性對照組第2次給藥后24 h脫頸椎脫臼處死;環(huán)磷酰胺陽性對照組給藥24 h后脫頸椎脫臼處死。

利用生殖毒性Ⅰ段試驗的雄性和雌性SD大鼠各80只，按照生殖毒性Ⅰ段試驗實驗方案大鼠分別ig給予雄黃0.125，0.25和0.55 g·kg－1，陰性對照組ig給予等容量的0.5%CMC-Na。雄性大鼠給藥42 d后交配，交配成功后處死，雌性大鼠給藥14 d后至妊娠第6天，妊娠第15天處死。雄黃0.125，0.25和0.55 g·kg－1組各取出6只大鼠的股骨用止血鉗夾碎，取骨髓用于骨髓細胞微核試驗和彗星試驗，取外周血做淋巴細胞微核試驗。

1.4 微核試驗測定微核率

骨髓微核試驗參照文獻［6］方法，取適量骨髓在凹孔瓷板內(nèi)，與大鼠血清混勻，滴加到載玻片上推片，自然干燥。每個標本制作2片。將推片放入甲醇中固定10 min，取出后放入Giemsa染液中染色20～30 min，純水沖洗，晾干。選擇細胞完整、涂片均勻、染色適當?shù)膮^(qū)域，在油鏡下觀察。用雙盲法讀片，每只動物計數(shù)2000個嗜多染紅細胞(polychromatic erythrocyte，PCE)，觀察含有微核的PCE數(shù)，計算微核率。外周血微核試驗取抗凝血120 μl加入40 μl新鮮配制的3%明膠溶液混勻，無氣泡后放入37℃水浴40 min，吸取上清液，145×g離心5 min，吸取上清液剩余約20 μl混勻后涂片，干燥后甲醇固定，然后放入Giemsa染液中染色20 min，純水沖洗，選擇細胞完整、涂片均勻、染色適當?shù)膮^(qū)域，在油鏡下觀察［6］。用雙盲法讀片，每只動物計數(shù)2000個淋巴細胞，觀察含有微核的淋巴細胞數(shù)，計算微核率。

1.5 彗星試驗測定拖尾率

參照文獻［8－9］介紹的方法，用1 ml預冷的HBSS沖洗股骨骨髓于1.5 ml離心管中。在磨砂載玻片上滴加0.6%正常熔點瓊脂糖500 μl，加蓋玻片作為第一層，4℃冷卻15 min后去掉蓋玻片，備用。取10 μl骨髓液與90 μl濃度為0.75%低熔點瓊脂糖混合，滴加到第一層凝膠上，加蓋玻片，冷卻后去掉蓋玻片。將載玻片緩慢放入裂解液中，4℃放置1.5 h。經(jīng)中和處理后將載玻片放入電泳槽中，加電泳液至覆蓋玻片，4℃放置45 min。接通電源25 V，電流量300 mA，4℃電泳25 min。經(jīng)中和處理后，采用吖啶橙20 mg·L－1染色，盡快觀察結果，拍照。每張片子在圖像分析系統(tǒng)上隨機計數(shù)50個細胞，記錄拖尾細胞數(shù)計算拖尾陽性率，測量拖尾長度。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 雄黃對小鼠骨髓細胞的遺傳毒性

2.1.1雄黃對小鼠骨髓細胞微核率的影響

與陰性對照組微核率(1.42‰)比較，ig給予雄黃0.25，0.5和1.0 g·kg－1組ICR小鼠微核率顯著升高，分別為3.0‰，4.4‰和7.0‰(P＜0.01);環(huán)磷酰胺0.05 g·kg－1組微核率為28.3‰(P＜0.01)。雄黃0.25，0.5和1.0 g·kg－1組PCE與總紅細胞比值為0.50～0.55，均屬正常范圍，且各組間無顯著性差異。

Tab.1 Effect of realgar on micronucleus rate in bone marrow cells in mice

2.1.2 雄黃對小鼠骨髓細胞彗星試驗拖尾率的影響

利用小鼠雄黃微核試驗的另一側股骨做骨髓細胞彗星試驗，表2結果顯示，與陰性對照組比較，雄黃0.25和0.55 g·kg－1組的拖尾陽性率和拖尾長度明顯升高(P＜0.01)。

Drug/

g·kg－1Tailing rate/%

Tailing length/μm

Tab.2 Effect of reaglar on tailing rate and tailing length of bone marrow cells by comet assay in male mice

2.2 雄黃對生殖毒性Ⅰ段試驗大鼠的遺傳毒性

2.2.1 雄黃對大鼠骨髓細胞微核率的影響

利用雄黃ig給藥生殖毒性Ⅰ段試驗的雄性和雌性大鼠做骨髓細胞微核試驗，表3結果顯示，與陰性對照組比較，雄黃0.25 g·kg－1雌性大鼠微核率顯著升高(P＜0.05)，雄黃0.55 g·kg－1雄性和雌性大鼠微核率顯著升高(P＜0.05)，并隨著劑量的增加微核率也增高。

Tab.3 Effect of reaglar on bone marrow cell micronucleus rate in both male and female rats from reproductive toxicology test

2.2.2 雄黃對大鼠外周血淋巴細胞微核率的影響

利用雄黃灌胃給藥生殖毒性Ⅰ段試驗的雄性和雌性大鼠做外周血淋巴細胞微核試驗，表4結果顯示，與陰性對照組比較，雄性0.55 g·kg－1組和雌性0.25和0.55 g·kg－1組的微核率顯著升高(P＜0.01)，并隨著劑量的增加微核率也增高。

Tab.4 Effect of reaglar on peripheral lymphocyte micronucleus rate in both male and female rats from reproductive toxicology test

2.2.3 雄黃對生殖毒性Ⅰ段大鼠骨髓細胞彗星試驗拖尾率的影響

利用生殖毒性Ⅰ段試驗處理時的雄性大鼠做骨髓細胞彗星試驗，表5結果顯示，與陰性對照組比較，雄黃0.125，0.25和0.55 g·kg－1組的拖尾陽性率和拖尾長度明顯升高(P＜0.05)。

Tab.5 Effect of reaglar on tailing rate and tailing length in comet assay in male rats from reproductive toxicology test

利用生殖毒性Ⅰ段試驗的雌性大鼠做骨髓細胞彗星試驗，表6結果顯示，與陰性對照組比較，雄黃0.125，0.25和0.55 g·kg－1組的拖尾陽性率和拖尾長度均升高(P＜0.05)。

Tab.6 Effect of reaglar on tailing rate and tailing length in comet assay in female rats from reproductive toxicology test

3 討論

雄黃是一味常用的礦物類中藥，《中國藥典》中收入的中成藥中6.3%含有雄黃。近年來研究表明，雄黃有肝腎毒性和細胞毒性［3－4，9］，但是對于雄黃是否有遺傳毒性文獻報道甚少，為此本研究進行了雄黃的遺傳毒性研究。

小鼠骨髓細胞微核試驗作為體內(nèi)遺傳毒性檢測的首選方法廣泛用于評價藥物的潛在遺傳毒性。彗星試驗(單細胞凝膠電泳試驗)因其簡便、靈敏、客觀性強和需要樣品量少等優(yōu)點，已被推薦為整體動物遺傳毒性檢測第二個靶器官的方法［10］。由于微核試驗和彗星試驗可在同一動物個體上取材進行試驗，因而具有相互印證和互補性的優(yōu)點，使實驗結果更具可靠性。

利用多次重復給藥試驗，在給藥結束階段取材做體內(nèi)遺傳毒性試驗，不僅節(jié)省大量的人力物力，減少動物用量，而且長期多次給藥更符合中藥復方的給藥方式，暴露其遺傳毒性，揭示潛在的遺傳毒性風險，這對于中藥的遺傳毒性評價來說尤為重要，但是至今未見到此類報道。在一些試驗中可以根據(jù)試驗的特點，將重復給藥和遺傳毒性實驗結合進行，在了解了藥物的藥理和藥代等研究基礎上，制定相關的實驗方案，選擇合適的靶器官分析，根據(jù)不同的情況來處理以符合二個實驗的技術要求。

根據(jù)《中國藥典》2005年版記載，雄黃成人用量為0.05～0.1 g。按成人臨床最高用量0.1 g，成人按60 kg體質(zhì)量計算約為1.67 mg·kg－1。在小鼠骨髓細胞微核試驗和彗星試驗中和利用大鼠生殖毒性Ⅰ段的微核試驗和彗星試驗中設計雄黃0.125，0.25和0.55 g·kg－1組分別相當于人臨床最高等效劑量的12.5倍、25倍和50倍，不同之處在于小鼠僅連續(xù)ig給藥2 d，而雄性大鼠連續(xù)ig給藥42 d以上，雌性大鼠19 d以上。結果顯示，無論是小鼠骨髓細胞微核試驗和彗星試驗，還是利用雄黃灌胃給藥生殖毒性Ⅰ段試驗大鼠大處理時取大鼠骨髓細胞微核試驗和彗星試驗，雄黃給藥各劑量組與陰性對照組比較，微核率和彗星形成率上升，且有明顯的量效關系，表明在此劑量條件下雄黃能引起染色體的損傷。

在重復給藥試驗中由于骨髓細胞的成熟分化進入外周血循環(huán)系統(tǒng)，從而可以利用外周血淋巴細胞進行微核檢測。用外周血淋巴細胞進行微核試驗具有取材方便、淋巴細胞在外周血停留時間長、微核容易判定，甚至可以活體動態(tài)連續(xù)地反映體內(nèi)微核數(shù)的變化情況，故在重復給藥的藥物毒性試驗中，可以考慮用外周血淋巴細胞微核試驗判斷藥物對遺傳物質(zhì)的損傷作用。

本研究用短期給藥(小鼠骨髓微核試驗和彗星試驗)和長期重復給藥(利用生殖毒性Ⅰ段試驗大鼠進行微核試驗和彗星試驗)組合來研究雄黃對小鼠和大鼠染色體的損傷作用，比較了不同給藥方式對遺傳毒性檢出的影響，探討結合多次重復給藥的試驗進行遺傳毒性研究的可行性。本研究結果表明:①利用生殖毒性Ⅰ段試驗多次給藥后取材做微核試驗和彗星試驗在方法上是可行的，可以節(jié)省動物資源，更符合動物福利和3R原則;在劑量設計上更符合中藥長期給藥方式;②外周血微核試驗結果顯示在重復給藥中具有采樣方便、觀察及判定容易的優(yōu)點;③同一個體內(nèi)微核試驗和彗星試驗的組合在評價藥物體內(nèi)遺傳毒性中具有相互印證和互補性;④在設計的劑量下雄黃具有遺傳毒性。上述結果可為今后利用重復給藥的長期毒性試驗或生殖毒性Ⅰ段試驗做遺傳毒性評價提供試驗依據(jù)。

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［10］ICH:International Conference on harmonization of requirements for registration of pharmaceuticals for human use(ICH)S2(R1)［EB/OL］.［2011-04-15］http://www.ich.org/products/guidelines/safety/article/safetyguideline.html

Genotoxicity of realgar by in vivo micronucleus test and comet assay

WU Wen-bin，ZHANG Chao-chao，TANG Jia-ming
(Center of Laboratory Animal，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China)

OBJECTIVETo detect the genotoxicity of realgar by using short-term administration(mouse bone marrow cell micronucleus test and comet assay)and long-term administration(rat bone marrow cell micronucleus test and comet assay in which bio-samples were collected from reproductive toxicity test)，and to study the possibility of detecting genotoxicity of realgar integrated with reproductive toxicity test.METHODSMice were ig administered with realgar suspension 0.25，0.5，and 1.0 g·kg－1for 2 d，before being sacrificed.Bone marrow cells were collected for micronucleus tests and comet assay.During early embryonic development，rats were ig given realgar 0.125，0.25 and 0.55 g·kg－1.The administration lasted at least 42 d for male rats and 19 d for females before they were allowed to mate.After mating successfully，the male rats were sacrificed the next day and the female rats on the 15th day of pregnancy.Then the bone marrow cells and peripheral blood lymphocytes were collected for micronucleus tests and comet assay.RESULTSCompared with negative control group，the micronucleus rate in bone marrow cells with realgar 0.25，0.5 and 1.0 g·kg－1groups was 3.00‰，4.40‰and 7.01‰，respectively.The tailing rate was 6.3%，9.7%and 11.3%，respectively(P＜0.05，P＜0.01).In reproductive toxicity rats，the micronucleus rate and lymphocyte micronucleus rate in peripheral blood of male rats with realgar 0.55 g·kg－1group were 2.83‰and 6.67‰while those of female rats with realgar 0.25 and 0.55 g·kg－1groups were 1.5‰and 2.25‰，2.58‰and 4.40‰，respectively.The comet tailing rate in realgar 0.125，0.25 and 0.55 g·kg－1group had significant differences(P＜0.05).CONCLUSIONIt is feasible to integrate the in vivo micronucleus test and comet assay into reproductive toxicity tests.Micronucleus tests in peripheral blood lymphocytes are simple.Realgar has genotoxicity at the designed doses.

realgar;micronucleus test;comet assay;mutagenicity test

The project supported by National Mega-project of Science Research of China(2009ZX09502-002)

TANG Jia-ming，E-mail:tangjiaming@hotmail.com，Tel:(021)51322647

R285.1，R394.6

A

1000-3002(2012)04-0550-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.04.015

國家重大新藥創(chuàng)制科技重大專項資助項目(2009ZX09502-002)

吳文斌(1980－)，男，助教，主要從事中藥毒理學研究，E-mail:wuwenbin2827@sina.com

湯家銘，E-mail:tangjiaming@hotmail.com，Tel:(021)51322647

2011-11-04接受日期:2012-04-24)

(本文編輯:付良青)