魏磊鑫 綜述 王擎 劉芳 審校

NO-cGMP信號(hào)途徑在干細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的作用

魏磊鑫 綜述 王擎 劉芳 審校

一氧化氮-環(huán)磷鳥(niǎo)苷（Nitric oxide–cyclic guanosine monophosphate，NO－cGMP）信號(hào)途徑介導(dǎo)了機(jī)體內(nèi)各系統(tǒng)的重要生理功能的實(shí)現(xiàn)。大量研究表明，NO-cGMP信號(hào)通路在干細(xì)胞向心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等的誘導(dǎo)分化中發(fā)揮重要的作用。此外，NO-cGMP信號(hào)通路還能促進(jìn)神經(jīng)軸突的延伸。本文就NO-cGMP信號(hào)途徑在胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cells，ESCs)、間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）、神經(jīng)干細(xì)胞（Neural stem cells，NSCs）等誘導(dǎo)分化中的作用進(jìn)行綜述。

一氧化氮-環(huán)磷鳥(niǎo)苷 信號(hào)途徑 干細(xì)胞 誘導(dǎo) 分化

一氧化氮（Nitric oxide，NO）是一個(gè)2價(jià)的游離自由基，也是哺乳動(dòng)物體內(nèi)重要的信號(hào)分子。NO對(duì)其下游分子的調(diào)節(jié)表現(xiàn)為環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（3’,5’-cyclic guanosine monophosphate,cGMP）依賴和非依賴兩種方式。前者受可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶（Soluble guanylyl cyclase，sGC）的調(diào)節(jié)，后者通過(guò)與金屬?gòu)?fù)合物、氧以及超氧陰離子的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)下游事件的發(fā)生。NO在細(xì)胞內(nèi)由一氧化氮合酶（Nitric oxide synthases，NOSs）催化生成，目前已知有3種形式的一氧化氮合酶：NOS-1，即神經(jīng)元型一氧化氮合酶（neuronal NOS，nNOS），主要分布于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元中，有調(diào)節(jié)血壓、舒張血管、松弛平滑肌等作用；NOS-2，即誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（Inducible NOS，iNOS），廣泛分布于肝、心肌、血管平滑肌細(xì)胞等，參與炎癥反應(yīng)；NOS-3，即內(nèi)皮型一氧化氮合酶（Endothelial NOS，eNOS），主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)揮擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種血管保護(hù)作用[1]。此外，NO還調(diào)控著軸突的生長(zhǎng)方向、突觸的可塑性、神經(jīng)元的存活和神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖分化等[2]。本文擬對(duì)NO-cGMP信號(hào)途徑相關(guān)分子在干細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的作用及應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。

1 NO-cGMP信號(hào)途徑相關(guān)分子

NO-cGMP信號(hào)途徑相關(guān)分子主要有NO、sGC、環(huán)核苷酸磷酸二酯（Cyclic nucleotide phosphodiesterases，PDEs）、cGMP、蛋白激酶G（Protein kinase G，PKG）等。sGC是體內(nèi)唯一已知的NO受體，是由α亞基和β亞基組成的異源二聚體，目前共發(fā)現(xiàn)4種亞型，其中僅α1/β1和α2/β1兩種亞型能被NO激活。sGCα1/β1廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物的組織中，在心、脾、肺、腦等組織中表達(dá)濃度高，而sGCα2/β1僅在腦組織中高表達(dá)[3-5]。PDEs是細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP和cGMP的催化水解酶，主要發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的作用[6]。cGMP是細(xì)胞內(nèi)重要的環(huán)核苷酸類第2信使，受sGC和PDEs的雙向調(diào)節(jié)：sGC催化cGMP的產(chǎn)生，而PDEs可以降解cGMP，使其恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，從而降低或終止cGMP的作用。cGMP通過(guò)激活cGMP依賴性PKG而發(fā)揮作用[7]。PKG是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，其活化后可使多種蛋白質(zhì)底物發(fā)生磷酸化，改變其活性狀態(tài)，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[8]。

2 NO-cGMP信號(hào)途徑相關(guān)分子在干細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的作用

2.1 對(duì)胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的作用

Krumenacker等[9]在未分化胚胎干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)其NOS-2、sGCα1和PKG的表達(dá)很低甚至不表達(dá)，但當(dāng)胚胎干細(xì)胞分化數(shù)天后可檢測(cè)到NOS-2 mRNA的表達(dá)，7～10 d后NOS-3的表達(dá)升高，在胚胎干細(xì)胞分化過(guò)程中 sGCα1、sGCβ1和PKG的表達(dá)都逐漸升高。對(duì)sGC活性的分析顯示未分化細(xì)胞中NO未能刺激cGMP的生成，而分化的胚體細(xì)胞經(jīng)NO作用后卻可產(chǎn)生豐富的cGMP。由此表明，NO-cGMP信號(hào)途徑相關(guān)分子在未分化的胚胎干細(xì)胞中作用很小，而在胚胎干細(xì)胞的早期分化和胚胎干細(xì)胞來(lái)源細(xì)胞的生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

2.1.1 誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向心血管細(xì)胞的分化

Mujoo等[10]研究顯示，cGMP的同源物8-bromo-cGMP可激活PKG而引起干細(xì)胞的分化；變構(gòu)的sGC激動(dòng)劑BAY41-2272和YC-1能顯著提高心肌特異轉(zhuǎn)錄因子和蛋白的表達(dá)；NO供體和sGC激動(dòng)劑的單獨(dú)應(yīng)用可促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化，聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)一步促進(jìn)心肌特異標(biāo)志物的表達(dá)。Mobley等[11]在胚胎干細(xì)胞中加入特異性的PKG抑制劑后，發(fā)現(xiàn)有更多的胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞。Kanno等[12]研究發(fā)現(xiàn)，NOS基因的轉(zhuǎn)入或外源NO的處理均可使心肌特異的基因及蛋白表達(dá)顯著增高，從而誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化：培養(yǎng)7 d時(shí)，肌鈣蛋白 T的表達(dá)率為（45.6±20.6）%，對(duì)照組僅為（9.25±1.77）%；2周內(nèi)，胚體中跳動(dòng)心肌的數(shù)目和大小都有所增加；電鏡及免疫細(xì)胞化學(xué)顯色結(jié)果顯示，NO誘導(dǎo)后細(xì)胞呈現(xiàn)出心肌的形態(tài)學(xué)特征，其中69%的轉(zhuǎn)NOS基因胚體出現(xiàn)自發(fā)性搏動(dòng)，NO供體處理的胚體則有45%的比例，而對(duì)照組卻只有約15%的比例。

2.1.2 誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化

新近的研究表明，NO－cGMP信號(hào)途徑還能促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化。Li等[13]發(fā)現(xiàn)人胚胎stage 1干細(xì)胞有24.3%的細(xì)胞共表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物nestin和nNOS，維甲酸（RA）的加入可以提高nNOS陽(yáng)性細(xì)胞率至33.9%，RA聯(lián)合cGMP后nNOS陽(yáng)性細(xì)胞又增至45.4%?？梢?jiàn)RA或RA合并cGMP能促進(jìn)nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元的分化效率，NO－cGMP信號(hào)途徑有利于人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)前體細(xì)胞的發(fā)育，并促進(jìn)其向功能性神經(jīng)元的分化。Gómez-Pinedo等[14]認(rèn)為，cGMP調(diào)節(jié)的NO信號(hào)途徑在胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)元的早期分化過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用，PDE抑制劑Sildenafil可在體內(nèi)誘導(dǎo)腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元。

2.2 對(duì)不同來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的作用

間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，MSCs廣泛分布于各種不同的組織中，如骨髓、牙周組織和脂肪等，MSCs具有向成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)（前體）細(xì)胞等細(xì)胞分化的多向分化潛能，NO-cGMP信號(hào)途徑在其中也發(fā)揮著重要作用。

2.2.1 對(duì)骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞分化的作用

細(xì)胞內(nèi)NO－cGMP水平的變化可以調(diào)節(jié)骨髓來(lái)源干/前體細(xì)胞的分化。Aicher等[15]研究發(fā)現(xiàn)，eNOS敲除小鼠的骨髓干細(xì)胞和前體細(xì)胞的活力受損，繼而可能影響到新生血管的形成。與此同時(shí)，eNOS敲除小鼠體內(nèi)由造血干細(xì)胞生成內(nèi)皮祖細(xì)胞的能力大大減弱，當(dāng)遭受缺血損傷時(shí)，組織再血管化能力喪失。

Chu等[16]的研究顯示，經(jīng)NO供體DETA-NONOate或硝普鈉處理48 h后，成鼠骨髓多能前體細(xì)胞（MAPCs）Oct-4 mRNA和蛋白的表達(dá)顯著提高了68%，細(xì)胞的增殖力下降了3倍以上，同時(shí)檢測(cè)到14 d時(shí)MAPCs向內(nèi)皮分化的細(xì)胞vWF的表達(dá)明顯升高。這些作用并不受GC抑制劑或cGMP同源物8-Br-cGMP的影響，說(shuō)明NO對(duì)MAPCs的多能性及分化的調(diào)節(jié)為cGMP非依賴途徑。

催產(chǎn)素可激活NO-cGMP信號(hào)途徑、誘導(dǎo)豬BMSCs向心肌類型的細(xì)胞分化并促進(jìn)細(xì)胞的增殖。Ybarra等[18]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)催產(chǎn)素處理后細(xì)胞的NOS基因和蛋白表達(dá)均升高，而經(jīng)NOS抑制劑L-NAME或/和sGC抑制劑ODQ作用后，心肌肌鈣蛋白Ⅰ基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)均明顯減少，其中ODQ的作用更明顯，心肌肌鈣蛋白Ⅰ和肌凝蛋白重鏈均減少，且催產(chǎn)素引起的細(xì)胞增殖效應(yīng)為NOS/sGC抑制劑所阻斷。

2.2.2 對(duì)牙周組織來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞分化的作用

牙周膜韌帶細(xì)胞具有成骨細(xì)胞的特性，Orciania等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在牙周膜來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)鈣離子和NO的濃度增高，提示局部合并NO供體作用于體外擴(kuò)增的牙周膜細(xì)胞，可能是治療牙周缺損的一個(gè)理想方法。

2.2.3 對(duì)脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞分化的作用

脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（ADMSCs）中，NO供體SNAP和DEA/NO可以同時(shí)激活cGMP依賴和非依賴途徑。Rebelatto等[20]研究發(fā)現(xiàn)，未處理的ADMSCs表達(dá)一些肌細(xì)胞的標(biāo)志物，NO產(chǎn)生的中間產(chǎn)物可引起ADMSCs心肌功能基因的表達(dá)。SNAP可增加ADMSCs一些肌細(xì)胞標(biāo)志物和VEGF的表達(dá)，提示經(jīng)SNAP處理的細(xì)胞可能具有更好的效果。Berardi等[21]將SNAP預(yù)處理的ADMSCs移植至大鼠梗死的心肌，30 d后與未處理細(xì)胞移植組相比，射血分?jǐn)?shù)有顯著改善，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示在預(yù)處理ADMSCs移植組，梗死區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)有肌鈣蛋白T–C、vWF等表達(dá)的升高。SNAP的處理可引起細(xì)胞內(nèi)S-nitrosation的表達(dá)，GSH/GSSG比降低，但cGMP水平不升高?？梢?jiàn)SNAP改變了ADMSCs的氧化還原環(huán)境，可能與其分化前狀態(tài)有關(guān)聯(lián)，這一改變可能促進(jìn)移植后心肌功能的恢復(fù)。

2.3 對(duì)神經(jīng)干/前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用

2.3.1 對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的作用

腦發(fā)育過(guò)程中，cGMP的減少可降低干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化能力，卻增強(qiáng)其向非神經(jīng)元方向的分化能力。Gomez-Pinedo等[14]以NOS抑制劑L-NAME處理孕鼠，使得胎鼠腦內(nèi)的cGMP減少至對(duì)照鼠的46%，大鼠孕14 d前額皮質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)元的數(shù)目減少到對(duì)照組的61%，合用PDE抑制劑Sildenafil處理后，神經(jīng)元的分化趨于正常，L-NAME的處理不減少BrdU標(biāo)記細(xì)胞的總數(shù)，也說(shuō)明了L-NAME選擇性地減少了干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化率，在海馬區(qū)也得到了相似的結(jié)果。結(jié)果顯示，cGMP調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的分化，高濃度的cGMP可促進(jìn)其向神經(jīng)元的分化，而低濃度的cGMP則促進(jìn)非神經(jīng)元類細(xì)胞的分化。

2.3.2 對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化的作用

NO可調(diào)節(jié)小鼠腦內(nèi)神經(jīng)前體細(xì)胞（Neural progenitor cells，NPCs）的增殖和分化。 Cheng等[22]以 L-NAME或 NO 清除劑hemoglobin處理培養(yǎng)的小鼠皮質(zhì)神經(jīng)前體細(xì)胞，可提高細(xì)胞的增殖能力，降低其分化為神經(jīng)元的能力；而NO供體硝普鈉則抑制NPC的增殖并增強(qiáng)其向神經(jīng)元的分化。BDNF也能減少NPC的增殖，增加分化神經(jīng)元nNOS的表達(dá)，其促神經(jīng)元分化效應(yīng)可被L-NAME和hemoglobin所阻斷。在鼠室下區(qū)NO也有著類似的調(diào)節(jié)作用，NOS抑制劑可提高NPC的增殖能力并抑制神經(jīng)元的分化。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明NO作為旁分泌信使，被新產(chǎn)生神經(jīng)元內(nèi)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)所刺激，從而調(diào)控NPC的增殖和分化。

大量研究表明，NO-cGMP信號(hào)途徑在干細(xì)胞誘導(dǎo)分化中發(fā)揮著重要作用，通過(guò)該信號(hào)途徑的活化，可以誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞及不同來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞等方向分化，促進(jìn)神經(jīng)干/前體細(xì)胞向神經(jīng)元的分化。將NO-cGMP信號(hào)途徑相關(guān)分子與其他干細(xì)胞誘導(dǎo)因子相結(jié)合，能提高不同來(lái)源干細(xì)胞的定向分化能力，將為干細(xì)胞在心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、周圍神經(jīng)損傷修復(fù)等方面的臨床治療提供新的方向。

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NO-cGMP Signaling in Stem Cell Differentiation

WEI Leixin,WANG Qing,LIU Fang.Department of Anatomy,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China.

LIU Fang(E-mail：liu_fang403@163.com).

Nitric oxide－cyclic guanosine monophosphate;Signaling;Stem cell;Induction;Differentiation

Q813.1+1

B

1673－0364（2012）04－0232－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.04.015

第二軍醫(yī)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新基金（ms2011041）。

200433 上海市 上海第二軍醫(yī)大學(xué)解剖學(xué)教研室。

劉芳（E-mail：liu_fang403@163.com）。

【Summary】The nitric oxide-cyclic GMP (NO-cGMP)signaling system mediates important physiological functions associated with various integrative body systems.Massive researches show that NO–cGMP signaling plays an important role in inducing the stem cells into the myocardial cell,neuron,etc.Besides,NO–cGMP signaling can also promote the axonal elongation.This review focuses on the role of NO-cGMP signaling in the differentiation of stem cells such as embryonic stem cells(ESCs),mesenchymal stem cells(MSCs)and neural stem cells(NSCs).

2012年6月17日；

2012年7月20日）