李伯翰 劉洪臣 鄂玲玲

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是目前世界上發(fā)病率較高的疾病之一，世界衛(wèi)生組織WHO已把OP列為中老年三大疾病之一。目前，我國OP患者約9000萬，約占總?cè)丝诘?.1%，隨著社會老齡化的進(jìn)程，其發(fā)病率呈上升趨勢，預(yù)計到2050年將增加至2.21億。OP可引起疼痛、骨骼變形、骨折等系列病發(fā)癥狀。骨質(zhì)疏松時，頜骨骨密度下降，生物力學(xué)性能降低，致使牙周炎及牙槽嵴加速吸收，在種植牙方面，可降低種植體的骨結(jié)合率、延長種植體骨結(jié)合的時間，導(dǎo)致種植的失敗。由于受牙、牙周和咀嚼習(xí)慣等因素等局部影響，頜骨骨質(zhì)疏松骨質(zhì)喪失有其自身的特點。因此，對OP大鼠頜骨組織蛋白表達(dá)的影響及相關(guān)機制的研究，有助于探尋頜骨骨質(zhì)疏松的發(fā)病機理，檢測相關(guān)的治療方案，預(yù)測治療效果。本文就蛋白質(zhì)組學(xué)在骨質(zhì)疏松癥及骨質(zhì)疏松癥頜骨相關(guān)蛋白表達(dá)的研究進(jìn)展作一綜述。

1.頜骨骨質(zhì)疏松實驗動物模型的建立

建立OP實驗動物模型是OP病因?qū)W與治療學(xué)中不可缺少的研究平臺。OP模型的選擇應(yīng)盡可能模擬臨床人類OP的形成機制和特征，且要求觀測指標(biāo)穩(wěn)定，重復(fù)性高。OP病理模型的方法很多，主要包括去勢法、低鈣飲食法、維甲酸法、糖皮質(zhì)激素法、廢用性骨質(zhì)疏松法[1-3]。去勢法是通過切除動物雙側(cè)卵巢造成雌激素的缺乏而形成骨質(zhì)疏松，可以較好地模擬絕經(jīng)后OP的骨代謝特點及臨床癥狀。卵巢切除后，雌激素水平迅速下降，骨吸收大于骨形成，骨量減少，骨強度下降。而且作用因素單一、模型確認(rèn)、重復(fù)性好，己成為標(biāo)準(zhǔn)化的絕經(jīng)后OP經(jīng)典病理模型，在研究中被廣泛應(yīng)用，也是美國FDA和WHO推薦的模擬婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的最佳動物建模方法[2]。但去勢法的造模時間相對長，而低鈣飲食法恰恰可以縮短骨質(zhì)疏松造模所需的時間。所以國內(nèi)外學(xué)者，也常將去勢法和低鈣飲食法結(jié)合使用，成為OP常用的造模方法。

OP型常用動物有大鼠、家兔、山羊、狗、猴等[1-5]，其中大鼠在OP的實驗研究中應(yīng)用最為廣泛。研究者在制備去勢模型時，常選用3-6月齡大鼠[4]。此時的大鼠性成熟不久，雖然可較快地復(fù)制出OP模型，但由于基本生理條件僅能代表年輕機體，與臨床絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病過程不盡吻合[6]而人類OP多在中年后期發(fā)生，故采用中老年大鼠可以復(fù)制出較為符合臨床特征的動物模型[7]。關(guān)于造模后骨質(zhì)疏松形成的時間，有研究報道[8]3月齡大鼠去卵巢后約50d，骨質(zhì)疏松模型能夠可靠形成。也有資料報道[9]雌性大鼠切除雙側(cè)卵巢后4周，骨密度、骨強度和骨鈣含量才均明顯低于空白對照組，因而認(rèn)為4周后骨質(zhì)疏松模型才形成。大鼠去卵巢4周后雌激素水平下降，促黃體素和促卵泡素水平上升[10]，骨代謝發(fā)生異常改變，破骨細(xì)胞骨吸收活動加速，骨轉(zhuǎn)換率增高(骨吸收超過骨形成)，松質(zhì)骨較皮質(zhì)骨丟失更為嚴(yán)重，骨無機鹽和有機質(zhì)丟失增加，腸道鈣吸收明顯降低等變化，造成骨密度下降，骨組織形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)遭到破壞[11]，導(dǎo)致骨生物力學(xué)性能的下降。

2.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

蛋白質(zhì)組(proteome)是指由一個基因組、一種細(xì)胞或組織在某一特定時刻所表達(dá)的包括所有亞型和修飾的全套蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)就是以蛋白質(zhì)組為研究對象，從整體角度分析研究細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成、表達(dá)水平、修飾狀態(tài)以及蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，探索生命現(xiàn)象的本質(zhì)和活動規(guī)律的科學(xué)[13-17]。蛋白質(zhì)組學(xué)是21世紀(jì)生命科學(xué)的重要戰(zhàn)略前沿，其三大支撐技術(shù)包括蛋白質(zhì)的分離、鑒定分析及生物信息學(xué)，在研究過程中通過鑒定蛋白質(zhì)組結(jié)構(gòu)、功能及各蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，最終實現(xiàn)對蛋白質(zhì)組表達(dá)模式和功能模式的研究。

蛋白質(zhì)組學(xué)中分離技術(shù)是至關(guān)重要的一步，最早的蛋白質(zhì)組學(xué)分離方法是蛋白質(zhì)的雙向電泳技術(shù)。其原理是根據(jù)蛋白在第一相中等電點的不同(使用固相pH梯度條即IPG)，在第二相中分子量的大小進(jìn)行分離(使用傳統(tǒng)的SDS－PAGE膠)，用不同的技術(shù)進(jìn)行染色來顯示這些蛋白質(zhì)點[12]。質(zhì)譜技術(shù)是指在蛋白質(zhì)組學(xué)中，先用多相分離技術(shù)處理樣品后，然后單個蛋白質(zhì)點或破片通常被胰酶消化最終成為肽片段，然后依據(jù)它們的肽段質(zhì)量指紋圖譜用質(zhì)譜分析去鑒定是何種蛋白。肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定的數(shù)據(jù)庫已經(jīng)建立。把實驗中經(jīng)酶消化的肽段的肽質(zhì)量指紋圖譜輸入數(shù)據(jù)庫就能確定蛋白質(zhì)氨基酸的序列[13-14]。與其他技術(shù)相比有幾個明顯的優(yōu)點，如高分辨能力和直接檢測蛋白質(zhì)的翻譯后調(diào)節(jié); 但缺點在于，它的高通量分析能力較弱，而且對分離過酸過堿，分子量太大太小的蛋白比較困難。兩個樣品不同蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，對定量蛋白質(zhì)組學(xué)提出了新的要求[15]。DIGE技術(shù)通過對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行雙向電泳前先用熒光進(jìn)行標(biāo)記然后將它們混合[16]。這種技術(shù)減少了膠內(nèi)誤差和假陽性率[17]，可以獲得有重大生物學(xué)意義的可靠數(shù)據(jù)。液相色譜質(zhì)譜法，不同的樣品分析前先用不同的標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記，如同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽(ICAT)同位素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAQ)[18]。其他體內(nèi)代謝標(biāo)記過程同樣得到發(fā)展，如培養(yǎng)細(xì)胞時一個用重氨基酸鏈15N[19,20]進(jìn)行標(biāo)記培養(yǎng)，對照組用沒有標(biāo)記的輕鏈進(jìn)行培養(yǎng)。蛋白質(zhì)組學(xué)中的絕對蛋白質(zhì)定量技術(shù)正嘗試測量絕對蛋白質(zhì)水平，通過引入特定蛋白質(zhì)標(biāo)志性肽段，提供一個詳細(xì)的外部對照標(biāo)準(zhǔn)來對需要測量的蛋白指標(biāo)進(jìn)行測量[21]。

3.基于蛋質(zhì)組學(xué)進(jìn)行的OP相關(guān)研究

最新的蛋白質(zhì)組學(xué)對骨質(zhì)疏松的研究重點集中在破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化及其功能。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究骨質(zhì)疏松癥取得了許多可喜的進(jìn)展。例如發(fā)現(xiàn)了與成骨細(xì)胞分化有關(guān)的新蛋白質(zhì)。楊軍[22]通過比較不同組間股骨蛋白質(zhì)分子以及圖譜，找到了相對應(yīng)的差異蛋白質(zhì)，根據(jù)它們質(zhì)和量的不同，分別命名為Creatine kinase M-type、Serotransferrin、Fructose-bisphosphate aldolase A。Salasznyk[23]用蛋白質(zhì)組學(xué)比較了人成骨細(xì)胞和人骨髓基質(zhì)細(xì)胞之間的蛋白表達(dá)差異[23]，這個研究集中于鑒定潛在的成骨標(biāo)記，結(jié)果顯示有737個不同的蛋白點。其中有257個(34%)點的在兩種細(xì)胞中都表達(dá)，剩下的480個點中有312(65%)證明僅在成骨細(xì)胞中表達(dá)。這個發(fā)現(xiàn)表明在成熟的成骨細(xì)胞和那些未分化的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組有著顯著差異。

Lee[24]應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究雌激素缺乏在大鼠骨蛋白質(zhì)表達(dá)中的作用，經(jīng)雙向凝膠電泳、質(zhì)譜和大鼠蛋白數(shù)據(jù)庫成功鑒定出3種明顯變化的蛋白質(zhì)，即硫氧還蛋白過氧化酶-1、阻凝蛋白輕鏈膚-2和泛素化酶E2-17kD，王海彬[25]等在此研究基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)其中泛素化酶E2-17kD為雌激素相關(guān)蛋白，其余兩種則首次報道為骨質(zhì)疏松相關(guān)蛋白；同時在實驗中設(shè)立中藥治療組，初步認(rèn)為這3種蛋白質(zhì)在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病及中藥治療過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。這些結(jié)果為闡明雌激素丟失相關(guān)骨質(zhì)疏松癥的分子機制，提供了實驗依據(jù)。總之，用定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究骨質(zhì)疏松還是一個新興領(lǐng)域，但是它將骨質(zhì)疏松的診斷和治療帶入一個全新的時代。

4.頜骨組織中OP相關(guān)蛋白

4.1 OP與頜骨的關(guān)系

多數(shù)學(xué)者的研究認(rèn)為，OP的部位差異性很大，頜骨與骨質(zhì)疏松間存在著一定的關(guān)系[25,26]。頜骨包繞牙齒部分的牙槽骨，作為全身骨代謝最活躍的部位，與全身骨質(zhì)疏松狀態(tài)具有高度的相關(guān)性，是最容易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松的部位之一[27]。Binte Anwar等[28]研究去卵巢的猴，將其牙槽骨的微結(jié)構(gòu)與腰椎骨礦物密度比較，發(fā)現(xiàn)去卵巢組的頜骨礦物密度較對照組明顯減低，第二磨牙的根間間隔區(qū)的骨小梁數(shù)、皮質(zhì)骨厚度均減少，間隔區(qū)骨也更多孔，由此得出結(jié)論：在這些猴中，雌激素的缺乏導(dǎo)致了磨牙區(qū)牙槽骨小梁結(jié)構(gòu)更脆弱。Jonasson等[29]研究表明，第一雙尖牙區(qū)牙槽骨厚度與前臂遠(yuǎn)中端骨密度密切相關(guān)，同時還發(fā)現(xiàn)尖牙與側(cè)切牙間牙槽突厚度亦與前臂遠(yuǎn)中端骨密度密切相關(guān)，因而認(rèn)為下頜骨骨密度可用于推測全身骨質(zhì)疏松狀態(tài)。Hirai等[30]的研究表明，OP的嚴(yán)重程度與剩余牙槽嵴高度呈負(fù)相關(guān)；同時剩余牙槽嵴的高度有明顯的性別差異，女性顯著低于男性，這與婦女絕經(jīng)后OP有關(guān)。王鐵梅等[31]通過計算機處理軟件對口腔牙周健康的40例老年性O(shè)P患者和80例健康對照組研究表明，頜骨骨密度與全身骨密度有一定的相關(guān)性。因此，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，全身性骨質(zhì)疏松與頜骨的骨礦丟失之間呈正相關(guān)，骨質(zhì)疏松與下頜骨的萎縮及牙槽骨吸收有顯著的相關(guān)性，絕經(jīng)后女性體內(nèi)雌激素水平降低，可導(dǎo)致牙槽骨骨質(zhì)丟失。

4.2 頜骨OP相關(guān)基因

尋找OP相關(guān)組織蛋白的研究在過去20年已廣泛進(jìn)行，這些研究基本上著重于以下幾個方面①尋找正常和病變組織中蛋白表達(dá)的差異，②研究不同的內(nèi)源性的調(diào)節(jié)因子(如激素、受體)的效果。③在藥物治療骨質(zhì)疏松的過程中蛋白表達(dá)的變化等等。

OP是由于骨形成障礙以及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性的不平衡而引起的，最近的蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要集中在這些細(xì)胞的分化和它們的功能研究上。來源于具有向多向分化潛能的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)的成骨細(xì)胞，可以合成骨基質(zhì)，而來源于單核細(xì)胞的破骨細(xì)胞可以吸收骨[32]。吳璇等[33]研究證實糖尿病骨質(zhì)疏松癥大鼠頜骨成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)以及成骨相關(guān)基因Runx2表達(dá)異常。

雖然蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在OP的應(yīng)用越來越廣泛，研究技術(shù)不斷進(jìn)步并取得了一些成績，但是該技術(shù)對OP頜骨組織蛋白這一領(lǐng)域的應(yīng)用目前還處于起步的階段，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并鑒定了高表達(dá)的頜骨骨質(zhì)疏松癥相關(guān)蛋白為數(shù)不多，其中一些如COMP、Coll2、MMPs先前的對骨關(guān)節(jié)炎疾病中就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，最近再次被蛋白質(zhì)組學(xué)證實是頜骨OP的生物標(biāo)志物[34]。Kawase等[35]從健康志愿者的牙槽骨獲取骨膜組織，檢測誘導(dǎo)成骨過程中蛋白質(zhì)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在成骨分化過程中，除了IL-6、ANG、LIF等已道的因子上調(diào)外，HSP-27的表達(dá)也明顯增加。但是，誘導(dǎo)成骨分化的機制目前仍不清楚，吳璇[36]發(fā)現(xiàn)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1及胰島素受體α1的在糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠下頜骨成骨細(xì)胞中高表達(dá)。

隨著21世紀(jì)生物技術(shù)的進(jìn)步和納米技術(shù)的興起，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)將日臻完善，自動化、高通量和高靈敏度等優(yōu)點將使其在骨質(zhì)疏松癥頜骨蛋白篩選，發(fā)生機制，骨質(zhì)疏松癥后組織修復(fù)再生工程以及生物靶向治療和藥物研發(fā)等研究領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。

5.小結(jié)

以上研究結(jié)果表明全身骨質(zhì)疏松與頜骨骨質(zhì)丟失具有密切的相關(guān)性,人口老齡化的增高，人類對于OP和頜骨骨量喪失的相關(guān)研究將會進(jìn)一步深化，近年來新發(fā)展起來的蛋白質(zhì)組學(xué)改變了傳統(tǒng)基因和蛋白質(zhì)檢測技術(shù)的局限性，具有全面性、高通量及大規(guī)模等優(yōu)點，可以從整體、動態(tài)和探索的角度對一個組織或細(xì)胞的基因組及其表達(dá)的全部蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，深入地探索骨質(zhì)疏松對頜骨骨丟失病理生理活動規(guī)律。蛋白質(zhì)組學(xué)及相關(guān)實驗技術(shù)的飛速發(fā)展，為骨質(zhì)疏松頜骨病變的研究提供了全新的視野和更為廣闊的技術(shù)平臺。

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