楊苗苗，王玉珠，曲良建，李孟樓，段彥麗，張永安*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西楊凌 712100;2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所國(guó)家林業(yè)局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091;3.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院園藝系，北京 102400)

近年來(lái)，松葉蜂類害蟲對(duì)我國(guó)森林危害呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，國(guó)內(nèi)主要種類有落葉松葉蜂Pristiphora erichsonii、落葉松銼葉蜂 P．laricis、落葉松腮扁葉蜂Cephalcia lariciphila、松阿扁葉蜂Acantholyda posticalis、靖遠(yuǎn)松葉蜂 Diprion jingyuanensis、南華松葉蜂 D．nanhuaensis、松鋸蜂 Diprion sp．、會(huì)澤新松葉蜂Neodiprion huizeensis、祥云新松葉蜂N．xiangyunicus、松黃葉蜂 N．sertifer、杉吉松葉蜂 Gilpinia disa等 30 多種［1－5］，分布于我國(guó)陜西、寧夏、甘肅、山西、山東、河北、四川、云南、廣西、浙江等20多個(gè)省(自治區(qū))。

作者在云南、陜西、山西、寧夏、河北、甘肅等地對(duì)松葉蜂的病原真菌進(jìn)行了采集、分離鑒定、毒力測(cè)試，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 病原真菌來(lái)源 在云南、陜西、山西、寧夏、河北、甘肅等地采集落葉松葉蜂繭、落葉松銼葉蜂繭、落葉松腮扁葉蜂繭、靖遠(yuǎn)松葉蜂繭、祥云新松葉蜂繭、松阿扁葉蜂幼蟲，收集其中的典型真菌侵染死亡的蟲繭。

1.2 病原真菌寄生率統(tǒng)計(jì) 隨機(jī)選取100枚以上松葉蜂蟲繭進(jìn)行解剖，根據(jù)繭內(nèi)幼蟲的病癥統(tǒng)計(jì)真菌寄生率。

1.3 病原真菌分離純化 在超凈臺(tái)上，用剪刀剪破蟲繭取出被真菌寄生的幼蟲僵尸，浸入70%乙醇中10～20 min，用無(wú)菌吸水紙吸干表面的乙醇，解剖幼蟲僵尸，取一小部分組織或用接種針直接挑取幼蟲表面的菌絲體置于PDA或馬丁氏培養(yǎng)基上，25℃恒溫箱中培養(yǎng)。4～6 d后在超凈工作臺(tái)上挑取長(zhǎng)出的菌絲接入新的培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)。以上程序重復(fù)數(shù)次，直到培養(yǎng)皿中的菌落大小、顏色、質(zhì)地等穩(wěn)定后，指形管保存菌種，待鑒定。

1.4 病原真菌初步鑒定 取待鑒定的真菌接種于盛有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中心位置，在培養(yǎng)皿2/3直徑處置無(wú)菌蓋玻片，其擱置方法為:玻片斜插入培養(yǎng)基中，傾角15°～20°。等培養(yǎng)皿中菌落邊緣到達(dá)蓋玻片時(shí)，即菌絲延伸至蓋玻片上時(shí)，取下蓋玻片，光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)。并結(jié)合寄主幼蟲死亡癥狀和菌落大小、顏色、質(zhì)地、生長(zhǎng)速度、菌絲寬度、是否有隔膜、孢子梗形態(tài)等特征，進(jìn)行初步鑒定［7－9］。

1.5 真菌的保存 在超凈臺(tái)上，將待保藏的真菌接入盛有培養(yǎng)基(斜面)的試管中培養(yǎng)(1株菌接4～5管)，25℃恒溫培養(yǎng)，取生長(zhǎng)良好的菌株作為保藏菌種;用消毒棉塞塞緊試管管口，外包牛皮紙，直立放在冰箱中4℃保存［7］。

1.6 5株白僵菌的毒力測(cè)試 選取NG-1，NG-2，SH-1，GT-1，YB-1等5株白僵菌，配成濃度為1.0×108孢子/mL菌液，用毛筆涂抹在新鮮干凈的月季葉片上，晾干后喂食3齡月季葉蜂幼蟲，25℃下進(jìn)行。每個(gè)菌株為1個(gè)處理，5個(gè)菌株共5個(gè)處理。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)用30頭幼蟲。接菌后前2 d的死亡蟲數(shù)不計(jì)，從第3天開始計(jì)數(shù)，持續(xù)16 d。根據(jù)培養(yǎng)皿中死蟲表面是否有菌絲長(zhǎng)出，蟲體是否僵硬等，計(jì)算死亡率、侵染率。

最后整理數(shù)據(jù)并采用Excel和SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原真菌寄生率 調(diào)查發(fā)現(xiàn)真菌寄生松葉蜂幼蟲期、繭蛹期、成蟲期的現(xiàn)象很普遍，但寄生率因松葉蜂種類和分布地不同而不同。松葉蜂繭期的主要病原為真菌(表1)，落葉松葉蜂繭期真菌寄生率較其它松葉蜂的高，寧夏固原地區(qū)落葉松葉蜂幼蟲期用白僵菌防治后，其繭的寄生率高達(dá)41.8%，未防治區(qū)僅為8.24%，防治區(qū)真菌的寄生率大約是未防治區(qū)的5倍，祥云新松葉蜂繭也有真菌寄生現(xiàn)象，真菌寄生率約為0.8%。

表1 幾種松葉蜂幼蟲期、繭期的病原真菌感病率

2.2 松葉蜂真菌鑒定結(jié)果分離鑒定出球孢白僵菌Beauveria bassiana 8株、布氏白僵菌B．brongniatii 4株、青霉屬Penicillium sp．真菌1株，并對(duì)以上真菌的發(fā)生狀況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表2)。

從表2可以看出，菌落大小方面SH-1、GT-1菌落較大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了其他11株，菌絲寬度和分生孢子直徑在1.9～3.1 μm之間。

2.3 5株白僵菌毒力測(cè)試結(jié)果 根據(jù)16 d的試驗(yàn)記錄，計(jì)算接種后月季葉蜂累計(jì)死亡率、總死亡頭數(shù)、總死亡率、總校正死亡率(表3)。對(duì)不同菌株感染試蟲后的累計(jì)死亡數(shù)、總死亡數(shù)逐日進(jìn)行多重比較分析發(fā)現(xiàn):前4 d各處理間均無(wú)顯著差異，從第6天起，不同菌株與對(duì)照比較均有顯著差異，第14天起GT-1和其它各菌株之間有顯著差異;對(duì)使用不同菌株后試蟲的總死亡數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn):各菌株與對(duì)照之間均有顯著差異，菌株GT-1與菌株NG-1，NG-2有顯著差異;以上菌株中GT-1對(duì)月季葉蜂幼蟲的致死作用最好，其它依次為:SH-1，YB-1，NG-2和NG-1。各菌株的校正死亡率從大到小依次為:GT-1，91.0%;SH-1，82.8%;YB-1，75.0%;NG-2，73.2%;NG-1，69.5%。

表2 4種松葉蜂繭寄生真菌鑒定結(jié)果

表3 不同菌株感染試蟲不同時(shí)間的累計(jì)死亡數(shù)、死亡率、校正死亡率

3 結(jié)論與討論

松葉蜂類害蟲真菌寄生主要集中在繭期，主要為白僵菌;落葉松葉蜂繭期真菌寄生率普遍高于其它松葉蜂。

本試驗(yàn)利用菌落、菌絲、孢子形態(tài)進(jìn)行了初步的鑒定，而要更準(zhǔn)確鑒定需要借助分子生物學(xué)手段;選取5株白僵菌毒力測(cè)試的結(jié)果顯示，對(duì)月季葉蜂的致死作用都在69.5%以上，而其它7株的毒力有待進(jìn)一步測(cè)試。Führer［10］研究發(fā)現(xiàn)真菌無(wú)法穿透完好無(wú)損的繭壁，即繭壁具有抵擋真菌侵染的功能，真菌侵染蛹是在結(jié)繭前期，同時(shí)提出結(jié)繭前期土壤中真菌孢子的濃度是影響真菌侵染的關(guān)鍵因子之一。所以在利用真菌防治該類害蟲時(shí)，要選擇好使用時(shí)間，并考慮有利于真菌繁殖的各類氣候因素，以期達(dá)到較好的防治效果。

［1］ 蕭剛?cè)幔S孝運(yùn)，周淑芷，等．中國(guó)經(jīng)濟(jì)葉蜂志:I［M］．陜西:天則出版社，1991:85－103．

［2］ 蕭剛?cè)幔袊?guó)森林昆蟲［M］．2版．北京:中國(guó)林業(yè)出版社，1991:1144－1200．

［3］ 蕭剛?cè)幔：τ退傻囊环N新葉蜂(膜翅目:松葉蜂科)［J］．林業(yè)科學(xué)研究，1994，7(6):663 －665．

［4］ 周淑芷，張真．我國(guó)松葉蜂研究概況及發(fā)展方向［J］．林業(yè)科技通訊，1994(11):10－12．

［5］ 蕭剛?cè)?，黃孝運(yùn)，周淑芷．中國(guó)松葉蜂(Diprionidae)昆蟲研究［J］．林業(yè)科學(xué)，1985，21(1):30 －34．

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［7］ 姚占芳，吳云漢．微生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)［M］．北京:氣象出版社，1998:23－47．

［8］ 邵力平，沈瑞祥，張素軒，等．真菌分類學(xué)［M］．北京:中國(guó)林業(yè)出版社，1984:110－130．

［9］ 魏景超．真菌鑒定手冊(cè)［M］．上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979:320－350．

［10］ E Führer S．Studies on the significance of pathogenic fungi in the population dynamics of the lesser Spruce Sawfly Pristiphora abietina Christ．(Hym．，Tenthredinidae) ［J］．Rosner A Applide Entomllogy，2001(125):235 －242．