金海強(qiáng)，賈斌，李熙英

(延邊大學(xué)教育部長(zhǎng)白山生物資源與功能分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林延吉 133002)

楊樹Populus spp.是我國(guó)北方地區(qū)速生豐產(chǎn)造林樹種之一，具有防風(fēng)固沙、水土保持，農(nóng)田保護(hù)和維護(hù)生態(tài)平衡等作用。楊樹腐爛病Cytospora chrysosperma等多種枝干病害經(jīng)常發(fā)生，直接危害楊樹生長(zhǎng)。目前對(duì)楊樹腐爛病的防治主要依靠物理、化學(xué)防治并結(jié)合抗病品種的選用等。化學(xué)農(nóng)藥見效快，防治效果好，但成本較高，易造成環(huán)境污染，病原菌易產(chǎn)生抗藥性等［1］。以往楊樹腐爛病的生物防治主要是篩選利用拮抗菌，但存在拮抗菌定植率差和防效不高、不穩(wěn)定等問(wèn)題［2-6］。近年來(lái)的研究結(jié)果表明，在健康的植物體中存在大量的內(nèi)生拮抗細(xì)菌，它們是植物病害防治的潛在資源菌［7-8］。植物內(nèi)生細(xì)菌長(zhǎng)期生活于植物體內(nèi)特殊環(huán)境并與植物協(xié)同進(jìn)化，建立了和諧聯(lián)合的關(guān)系。一方面植物為內(nèi)生細(xì)菌提供了良好的棲息地，另一方面內(nèi)生細(xì)菌又可通過(guò)自身代謝產(chǎn)物或借助于信號(hào)傳導(dǎo)作用對(duì)植物產(chǎn)生影響，對(duì)寄主植物有促生、防病等多方面的生物學(xué)作用［9］。本研究從健康楊樹枝條中分離篩選出對(duì)楊樹腐爛病具有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌，為楊樹腐爛病生物防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種 楊樹腐爛病病原菌Cytospora chrysosperma來(lái)自延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室。

1.2 內(nèi)生細(xì)菌分離材料 分別于春季的3月中旬、夏季的7月中旬和秋季的10月中旬從吉林省延邊地區(qū)的延吉、龍井、安圖、和龍等地的楊樹林(品種為大青楊)中采集楊樹枝條，隨機(jī)取樣。樹齡為5～7 a，枝條直徑1 cm左右，長(zhǎng)20 cm。

1.3 楊樹內(nèi)生細(xì)菌的分離及純化 取不同地點(diǎn)采集到的楊樹枝條，用70%的酒精表面清洗后，剪成0.5～1 cm的枝段，浸泡在70%乙醇中1 min，再用3.25%的NaOCl浸泡15 min，用無(wú)菌蒸餾水沖洗4次，放置在PDA平板上培養(yǎng)2 d。

從上述培養(yǎng)基平板里挑出沒(méi)長(zhǎng)出微生物菌落的(說(shuō)明表面消毒徹底)楊樹枝條段5g放入已滅菌的研缽中，加入45 mL無(wú)菌水，碾碎，攪拌5 min，靜止15 min，按稀釋法稀釋后用10-3，10-4的稀釋液涂抹于PDA和NA培養(yǎng)基平板上，放入25℃的恒溫箱中培養(yǎng)。每處理重復(fù)5個(gè)培養(yǎng)皿。培養(yǎng)第5天，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地等調(diào)查微生物菌株數(shù)和每種微生物的菌落數(shù)，并對(duì)每種微生物進(jìn)行純培養(yǎng)以作為參試菌株。

1.4 室內(nèi)拮抗菌的篩選 在PDA平板上培養(yǎng)7 d的楊樹腐爛病菌菌落上，用打孔器打出直徑5 mm的菌碟，放置于新的PDA平板中間，在距培養(yǎng)皿邊緣10 mm處點(diǎn)接內(nèi)生細(xì)菌菌株(2個(gè)點(diǎn)對(duì)稱)，設(shè)只接病原菌的為對(duì)照，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)5次。培養(yǎng)第5天測(cè)楊樹腐爛病菌菌落寬度，并計(jì)算抑菌率。

1.5 拮抗菌發(fā)酵液的抑菌活性 選擇在對(duì)峙培養(yǎng)中對(duì)楊樹腐爛病菌具有較強(qiáng)抑菌活性的14種內(nèi)生拮抗菌，用KB培養(yǎng)基活化培養(yǎng)3 d后，分別接種于200 mL KB液體培養(yǎng)基中，在28℃、120 r/min恒溫雙層搖床中振蕩培養(yǎng)5 d。在經(jīng)4 000 r/min離心25 min后，取上清液用直徑0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至10 mL，即為拮抗菌發(fā)酵液。

抑菌活性測(cè)定采用紙片法。具體方法如下:先在PDA平板中間放置直徑5 mm的楊樹腐爛病菌的菌碟1片，在距離菌碟10 mm處放置滴150 μL拮抗菌發(fā)酵液的濾紙片2片(2片對(duì)稱)，以只放置楊樹腐爛病菌菌碟的為對(duì)照，放入25℃恒溫箱培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)5次。培養(yǎng)5 d后測(cè)楊樹腐爛病菌菌落寬度，并計(jì)算抑菌率。

1.6 離體枝條防病試驗(yàn) 在PDA平板上培養(yǎng)7 d的楊樹腐爛病菌菌落上，用打孔器打出直徑5 mm的菌碟，備用。

將14種內(nèi)生拮抗菌在KB培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)3 d后，分別接入100 mL KB液體培養(yǎng)基中，在28℃、120 r/min恒溫雙層搖床中振蕩培養(yǎng)5 d，備用。

將直徑1.5～2.5 cm楊樹枝條剪成段，每段長(zhǎng)30 cm。用75%酒精表面消毒，在距兩頭5 cm處用消毒好的解剖刀劃開“T”字形口，先滴內(nèi)生拮抗菌培養(yǎng)液1 mL，然后接楊樹腐爛病菌菌碟1片。用蘸無(wú)菌水的脫脂棉保濕，用膠布將其固定，枝條兩頭同樣需用蘸水脫脂棉保濕。每一組有30個(gè)枝條。其中只接腐爛病病菌的枝條為對(duì)照。最后每種處理放在一個(gè)塑料袋中，在室溫下(21℃左右)培養(yǎng)。40 d后調(diào)查發(fā)病率、病斑大小、病級(jí)及愈傷組織形成情況。楊樹腐爛病病級(jí)調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參見文獻(xiàn)［10］。

1.7 拮抗菌菌株的鑒定

1.7.1 拮抗菌形態(tài)及生理生化特性 將菌株Y-SY12接種在NA平板上，培養(yǎng)1 d后進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)和菌落特征。

1.7.2 16S rDNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析 以菌株Y-S-Y12 DNA為模板，利用16S rDNA通用引物對(duì) 27F-FOR(5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1492R-REV(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)為探針進(jìn)行16S rDNA分析。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94℃ 變性 5 min;94℃ 變性 40 s，55℃ 復(fù)性40 s，72℃延伸1 min，循環(huán)數(shù)為35。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，將擴(kuò)增得到的片段連接到pMD18-T載體上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli DH5α后測(cè)序。所得16S rDNA片段序列在NCBI GenBank上利用BLASTN模塊進(jìn)行BLAST，對(duì)16S rDNA序列進(jìn)行同源性分析;根據(jù)BLAST結(jié)果，將與Y-S-Y12在16S rDNA序列上的同源性超過(guò)96.6%的前20個(gè)菌株的16S rDNA序列利用DNASATR軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹內(nèi)生細(xì)菌的分離 供試2種培養(yǎng)基上均能分離到內(nèi)生細(xì)菌，其中PDA培養(yǎng)基上分離到的內(nèi)生細(xì)菌菌株數(shù)多于NA培養(yǎng)基上;NA培養(yǎng)基上出現(xiàn)的內(nèi)生細(xì)菌菌落數(shù)多于PDA培養(yǎng)基上。從不同時(shí)間段上分離到的內(nèi)生細(xì)菌菌株數(shù)和菌落數(shù)量上看，春季分離到的最少，夏季分離到的最多，秋季分離到的比夏季少(見表1)。

采用平板稀釋法，從大青楊楊樹枝條中共分離純化得到56株內(nèi)生細(xì)菌菌株。

表1 不同季節(jié)楊樹枝條中分離到的內(nèi)生細(xì)菌菌株數(shù)與菌落數(shù)

2.2 對(duì)楊樹腐爛病菌具有高效抑菌作用的內(nèi)生拮抗菌篩選 分離到的56株內(nèi)生細(xì)菌菌株與楊樹腐爛病菌進(jìn)行室內(nèi)對(duì)峙培養(yǎng)，結(jié)果23株具有拮抗作用，其中14株內(nèi)生拮抗菌菌株的抑菌率達(dá)到了60%以上(見表2)。Y-S-Y2，Y-S-Y12的抑菌率最高，達(dá)到了 100%;其次為 Y-S-Y3，抑菌率為92.68%;再次為Y-S-Y1，抑菌率為73.17%;其余的抑菌率均在60%～70%之間。

表2 楊樹內(nèi)生拮抗菌對(duì)楊樹腐爛病菌的室內(nèi)抑菌效果

2.3 拮抗菌發(fā)酵液對(duì)楊樹腐爛病菌的抑菌活性供試14種內(nèi)生拮抗菌菌株發(fā)酵液對(duì)楊樹腐爛病菌均具有一定的抑菌活性，其中Y-S-Y12菌株發(fā)酵液的抑菌活性顯著高于其它內(nèi)生拮抗菌代謝產(chǎn)物的粗提取液的抑菌活性，其抑菌率為67.78%;其次Y-SY2，Y-S-Y8，Y-S-Y13，這三者之間沒(méi)有顯著性差異。另外，Y-S-Y7，Y-S-Y9，Y-S-Y10，Y-S-Y18，YS-Y20等5種也具有較高的抑菌活性，其抑菌率均為50%以上。詳見表3。

表3 楊樹內(nèi)生拮抗菌發(fā)酵液對(duì)楊樹腐爛病菌的抑菌活性

2.4 離體枝條防病試驗(yàn) 結(jié)果見表4。

從發(fā)病率上看，除Y-S-Y7處理的發(fā)病率與對(duì)照之間沒(méi)有顯著性差異外，其它各處理與對(duì)照之間均有顯著性差異。其中以Y-S-Y12處理的發(fā)病率最低，為31.67%;其次為Y-S-Y2;再次為Y-S-Y13和Y-S-Y1。從防效上看，各處理均有一定的防治效果，其中Y-S-Y12處理的防效最高，為84.95%;其次為Y-S-Y2，防效為80.64%;再次為Y-S-Y1和YS-Y13，防效分別為73.11%和71.05%，之間沒(méi)有顯著性差異。這幾種防效高的處理枝條愈傷組織形成情況也較好，其中Y-S-Y12和Y-S-Y2處理的愈傷組織形成率分別為66.2%和62.2%;Y-S-Y1和YS-Y13處理的愈傷組織形成率分別為50.3%和52.4%。這說(shuō)明，防病效果較高的內(nèi)生拮抗細(xì)菌對(duì)楊樹枝條形成愈傷組織也有促進(jìn)作用。

表4 離體枝條上內(nèi)生拮抗菌對(duì)楊樹腐爛病的防病效果

2.5 拮抗菌的鑒定

2.5.1 拮抗菌形態(tài)及培養(yǎng)特征 在室內(nèi)抑菌試驗(yàn)和楊樹枝條防病試驗(yàn)中表現(xiàn)突出的Y-S-Y12菌株的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征:在NA平板上菌落表面粗糙不透明，有褶皺，乳白色至淡黃色。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞呈短桿狀，大小為(0.6～0.7)μm×(2.0～2.5)μm，產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色陽(yáng)性。

2.5.2 16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析 在NCBI Genbank上進(jìn)行的16S rDNA序列分析的結(jié)果表明，本研究中所分離的Y-S-Y12菌株屬于芽孢桿菌屬Bacillus;與Y-S-Y12菌株16S rDNA序列(Gen-Bank登錄號(hào)為JX094152)同源性超過(guò)99.5%的菌株有 136個(gè)。其中，解淀粉芽孢桿菌 Bacillus amyloli-quefaciens菌株 SWM1的16S rDNA序列(GenBank登錄號(hào)為JN851189)與Y-S-Y12菌株的同源性最高，達(dá)99.8%(見圖1、表4)，其BLAST得分(Max Score)為2778，E-value為0;這兩個(gè)菌株的16S rDNA序列的目標(biāo)序列1 513 bp中僅有3個(gè)堿基存在差異。雖然Y-S-Y12與芽孢桿菌屬的其他菌株B．subtilis(菌株Aj080718IA-2)及 GJ24在16S rDNA序列上同源性也達(dá)到了99.7%，但在菌落特性上存在不同。結(jié)合形態(tài)學(xué)及培養(yǎng)特征，菌株Y-SY12初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens。

圖1 拮抗菌株Y-S-Y12與相關(guān)菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

表4 Y-S-Y12與芽孢桿菌屬20個(gè)菌(株)的16S rDNA序列一致性Percent ldentity

3 結(jié)論及討論

本試驗(yàn)中，在各地采集到的楊樹枝條中分離純化得到56株內(nèi)生細(xì)菌。與楊樹腐爛病菌進(jìn)行室內(nèi)對(duì)峙培養(yǎng)中，結(jié)果23株具有拮抗作用，其中14株內(nèi)生拮抗菌的抑菌率60%以上。

通過(guò)室內(nèi)對(duì)峙培養(yǎng)、檢測(cè)內(nèi)生拮抗細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)楊樹腐爛病菌的抑菌作用以及室內(nèi)離體枝條防病試驗(yàn)，楊樹內(nèi)生拮抗細(xì)菌Y-S-Y12菌株對(duì)楊樹腐爛病的抑菌防病作用最顯著，其次為Y-S-Y2菌株。對(duì)Y-S-Y12菌株采用16S rDNA的序列分析方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果為解淀粉芽孢桿菌。

解淀粉芽孢桿菌能產(chǎn)生脂肽類抗生素、聚酮類抗生素以及抗菌蛋白等多種抗菌物質(zhì)，這些代謝產(chǎn)物具有廣泛抑制植物病原真菌［11-12］和植物病原細(xì)菌［13-14］的活性，但還沒(méi)發(fā)現(xiàn)有關(guān)抑制楊樹腐爛病菌的報(bào)道。本試驗(yàn)中分離到的解淀粉芽孢桿菌在室內(nèi)條件下對(duì)楊樹腐爛病有明顯的防病作用，但在田間的防效如何、對(duì)楊樹生長(zhǎng)有沒(méi)有促進(jìn)作用，對(duì)其他病害有沒(méi)有防病作用、如何開發(fā)生物農(nóng)藥以及使用方法等有待于進(jìn)一步研究。

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