郭 玫， 翟蘊新， 孟令慧

全反式維甲酸對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力及海馬Aβ蛋白沉積的影響

郭 玫1， 翟蘊新2， 孟令慧1

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的主要臨床表現(xiàn)為學習記憶障礙，組織病理上可見老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(NFT)和基底前腦膽堿能神經(jīng)元丟失［1］，其中老年斑的主要成分為β淀粉樣蛋白(β－amyloid protein，Aβ)。AD的病因還不是很清楚，很多學者認為Aβ的沉積是AD的始發(fā)因素，因此，針對Aβ的治療措施將成為一種很有潛力的治療方法。近年來，有研究［2］證明全反式維甲酸(all－trans retinoic acid，ATRA)具有抑制Aβ沉積的作用，本實驗通過對AD模型大鼠行為學水平的評價和海馬Aβ蛋白沉積的檢測，探討全反式維甲酸對AD模型大鼠學習記憶能力的影響及相應機制。

1 材料和方法

1.1 主要儀器設備 大鼠立體定位儀(日本東京成茂科學器械研究所);水迷宮(北京新天地公司);切片機(德國Leica);光學顯微鏡(日本Olympus);顯微圖像分析儀(日本Olympus)。

1.2 主要藥品和試劑 Aβ1－40試劑(美國Sigma公司); ATRA(美國Sigma公司);兔抗大鼠Aβ1抗(美國Sigma公司);羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程公司);SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。

1.3 實驗動物分組 220～250g健康雄性SD大鼠(購于中國醫(yī)大動物部)，于造模前進行水迷宮訓練3d，剔除差異明顯者，隨機分為實驗組、AD模型組和對照組，每組6只。實驗組:大鼠制成AD模型3d后，按20mg/kg的劑量腹腔注射ATRA，每周3次，連續(xù)注射8w。AD模型組:大鼠制成AD模型3d后，腹腔注射等容積溶解液，每周3次，連續(xù)注射8w。對照組:大鼠大腦海馬區(qū)注射5μl生理鹽水3d后，再腹腔注射等容積溶解液，每周3次，連續(xù)注射8w。

1.4 AD動物模型的制作 首先孵育Aβ1－40，用生理鹽水溶解Aβ1－40，配成10μg/μl的溶液。37℃孵育1w，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)的 Aβ1－40。大鼠經(jīng) 10%水合氯醛腹腔麻醉(300mg/kg)后，固定于立體定位儀上，常規(guī)備皮消毒，切開頭部皮膚，暴露硬腦膜。定位海馬CA1區(qū)為注射靶區(qū)(前囟后3.0mm，中線旁開2.2mm，顱骨表面下2.8mm)，微量進樣器自腦表面垂直進針，將Aβ1－401μl緩慢注入，注射速度為5μl/ h，留針10min以保證溶液充分彌散，然后緩慢撤針，縫合切口，所有操作均在無菌條件下進行。對照組注入等體積生理鹽水。術后動物單籠飼養(yǎng)，3d后進行水迷宮試驗，逃避潛伏期明顯延長者為造模成功。

1.5 水迷宮試驗 參照Morris［3］方法進行。大鼠在造模前訓練3d，記錄大鼠從入水到找到并爬上平臺的時間，此時間稱逃避潛伏期，每一時間段內4次潛伏期的算術平均數(shù)為這一時段的成績進行統(tǒng)計分析，根據(jù)第3天成績剔除差異明顯者。造模3d后進行水迷宮試驗，檢測造模是否成功。給藥8w后再次行水迷宮試驗，檢測ATRA對大鼠學習記憶能力的影響。

1.6 免疫組化法檢測Aβ蛋白 水迷宮實驗后次日即進行Aβ蛋白免疫組化染色。10%水合氯醛腹腔麻醉，經(jīng)左心室灌注生理鹽水，沖凈體內血液，然后用4%多聚甲醛液灌流固定，取腦，取材范圍為前囟后2.3～3.8mm，置于4%多聚甲醛中后固定24h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，每隔100μm連續(xù)作6μm厚腦冠狀面石蠟切片。常規(guī)脫蠟至水，3%的去離子水孵育10min，以消除內源性過氧化物酶活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡3min，滴加山羊血清室溫孵育lh，傾去。滴加1∶600稀釋的兔抗大鼠Aβ蛋白一抗，4℃過夜。PBS沖洗3min×3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃作用30min。PBS洗3min ×3次，滴加試劑SABC，37℃20min。PBS洗5min×4次，滴加DAB顯色劑，室溫顯色，鏡下控制反應時間。蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片。每個標本取3張切片，顯微圖像分析系統(tǒng)采集圖像，細胞漿中呈棕黃色顆粒者為陽性細胞。在400倍高倍鏡下，隨機觀察海馬區(qū)不重疊的5個視野，計數(shù)陽性細胞面積百分比并分別計算其算術平均數(shù)。

2 結果

2.1 水迷宮試驗結果 造模3d后，AD模型組(25.7± 3.93s)和實驗組(27.3±3.91s)逃避潛伏期均較對照組(10.3±2.24s)明顯延長(P＜0.05);給藥8w后，AD模型組(36.6±5.27s)和實驗組(22.4±3.85s)逃避潛伏期均明顯長于對照組(8.9±1.96s)(P＜0.05)，實驗組逃避潛伏期明顯短于AD模型組(P＜0.05)。

2.2 Aβ在腦內沉積情況 對照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列規(guī)則、緊密，形態(tài)完整，未見Aβ沉積，AD模型組和實驗組海馬神經(jīng)元缺失，可見Aβ沉積;實驗組陽性細胞(4.54± 0.68%)顯著少于AD模型組(6.98±0.69%)(P＜0.05)。

3 討論

在阿爾茨海默病(AD)病理機制的研究中，淀粉樣蛋白級聯(lián)反應假說是廣為接受的一個學說。該假說基本觀點為Aβ的聚集和沉積及其伴隨的神經(jīng)元損害是老年癡呆病理機制的中心環(huán)節(jié)。Aβ在腦組織沉積會形成老年斑，同時引起tau蛋白高度磷酸化，繼而形成神經(jīng)元纖維纏結。Aβ的沉積還能引起各種免疫炎癥反應和神經(jīng)毒性級聯(lián)反應，導致以海馬和大腦皮質為主的廣泛的神經(jīng)元變性、死亡，出現(xiàn)漸進性的神經(jīng)遞質主要是膽堿能和多巴胺能遞質減少，最終導致記憶和認知功能障礙，產(chǎn)生AD癥狀。

全反式維甲酸(ATRA)是維生素A在體內的活性代謝物，維生素A具有強大的抗氧化和抗細胞變性的作用，而氧化和細胞變性是一系列神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病包括AD的病理基礎。研究發(fā)現(xiàn)缺乏維生素A會導致大鼠大腦皮質Aβ的聚集［4］和嚙齒類動物記憶的下降［5］。空間學習和記憶的下降不僅見于維生素A缺乏的動物，也見于老齡嚙齒類動物［6］，給予繼甲酸(維生素A酸，retinoic acid，RA)可使癥狀得到改善。進一步的臨床研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦內存在類維生素A轉運和功能的缺陷［7］，提示提高腦內類維生素A的利用可能預防或減少與Aβ相關的神經(jīng)變性［7，8］。維生素A在細胞質內轉化為ATRA［9］，盡管RA具有多種立體異構體，但多以ATRA的形式存在。在試管中［2］，RAα受體信號系統(tǒng)可阻止細胞內外Aβ的沉積，這種作用與金屬蛋白10的表達增加有關，金屬蛋白10是一種α分泌酶，通過使淀粉前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)進入到無淀粉通路，阻止Aβ形成。ATRA還可在試管中減少新鮮的Aβ向纖維狀Aβ轉化［10］，減少Aβ沉積。連續(xù)8w給予5月齡APP/PS－1轉基因小鼠ATRA［11］，發(fā)現(xiàn)ATRA可通過下調p35的水平調節(jié)Aβ的軸突運輸，減少Aβ的沉積，同時ATRA可下調細胞周期依賴性蛋白激酶(Cyclin dependent kinase，CDK)的水平，而在既往的研究中［12～14］，CDK在神經(jīng)元APP的磷酸化過程中起著關鍵作用。

以上的研究表明ATRA作用于Aβ沉積的多個步驟，減少Aβ的生成，抑制Aβ的聚集和沉積，但鮮少有研究證明ATRA對AD確有治療效果。本研究利用立體定位海馬內注射Aβ建立AD動物模型，通過水迷宮實驗檢測動物模型學習記憶能力的改變，免疫組化方法檢測海馬Aβ蛋白沉積，探討ATRA對AD大鼠學習記憶能力的影響及病理的改變。結果顯示ATRA組水迷宮逃避潛伏期較AD模型組明顯縮短，同時AD模型組和治療組海馬神經(jīng)元缺失，周圍出現(xiàn)膠質細胞反應，且ATRA組海馬Aβ的沉積明顯少于AD模型大鼠，表明ATRA可以改善AD動物模型的認知功能，這種治療作用可能與海馬Aβ的沉積減少有關，這與Ding等［11］的研究結果一致。Ding發(fā)現(xiàn)ATRA在抑制APP/PS－1轉基因小鼠Aβ沉積的同時，還可能通過下調CDK5的水平減少tau蛋白磷酸化，同時顯著減少活化的小膠質細胞和星型膠質細胞。ATRA還能夠克服由 Aβ肽介導的膽堿乙酰轉移酶的下降［15］，使膽堿乙酰轉移酶維持在正常水平，以保證膽堿能遞質的運轉和功能。

目前AD治療研究的方向都是抑制Aβ產(chǎn)生、促進其降解或加強其從腦內清除。Aβ1－40肽誘導產(chǎn)生的抗Aβ抗體，可以使腦內Aβ沉積顯著減少，改善轉基因鼠的學習和認知功能［16］，但多中心的臨床試驗因患者出現(xiàn)腦膜腦炎的副反應而被中止［17］。神經(jīng)生長因子對損傷神經(jīng)元具有保護和修復作用，然而由于血腦屏障的緊密連接，常規(guī)給藥腦內濃度極低。尼莫地平對老年癡呆癥和腦血管痙攣有效，但肝首過效應嚴重，在腦內靶位的含量更低。ATRA作為脂溶性小分子，能夠輕易跨越細胞膜屏障，全身給藥后在腦組織高度集中［18］，且毒理學性質已確立，若能確定對AD的治療作用，是一種可行性極高的治療手段。我們應加大樣本量，繼續(xù)探索ATRA對AD動物模型的作用及機制，為AD的臨床治療提供理論依據(jù)。

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1003－2754(2012)06－0549－02

R742

2012－02－29;

2012－05－28

(1.沈陽醫(yī)學院沈洲醫(yī)院神經(jīng)內科，遼寧沈陽110002;2.沈陽市第一醫(yī)院神經(jīng)內科，遼寧沈陽110002)