李竹英 王 玨 王晶波 劉建秋

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

惡性胸水是泛指惡性腫瘤的胸膜轉(zhuǎn)移或胸膜自身惡性腫瘤所致的胸腔積液，是癌癥晚期的一種常見并發(fā)癥［1］，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。本研究通過觀察瀉肺逐飲湯聯(lián)合力爾凡對惡性胸水大鼠胸水及胸膜組織中轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1的影響，探討了瀉肺逐飲法防治惡性胸水的作用機(jī)理，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 Wistar清潔級大鼠100只，雌雄各半，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院實驗動物中心，體質(zhì)量（220±20）g。大鼠雌雄分籠于室溫約23℃，黑夜和白晝各12 h的環(huán)境中，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進(jìn)行造模。

1.2 藥物 瀉肺逐飲湯：由葶藶子、黨參、生黃芪、薏苡仁、山慈菇、桂枝、白術(shù)、茯苓、椒目、甘草組成。上藥以常溫常壓煎藥機(jī)煎煮而成，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室提供。力爾凡：吉林省一心制藥有限公司生產(chǎn)，批號10970426，規(guī)格：10 mg/支，以生理鹽水按1∶1比例稀釋。

1.3 試劑及瘤株 艾氏腹水瘤（EAC）細(xì)胞株，購自南京康克諾德實驗動物有限責(zé)任公司。石蠟、4%多聚甲醛、乙醇、蘇木精、伊紅等，均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科提供。兔抗大鼠TGF-β1免疫組化試劑盒：購自北京中山生物技術(shù)有限公司。生物素化山羊抗兔IgG（H+L）：購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。辣根酶標(biāo)記鏈親和素：購自上海研域化學(xué)試劑有限公司。顯色劑DBA：購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。烏拉坦，北京通州育才精細(xì)化工廠，批號980922。

1.4 儀器 光學(xué)顯微鏡：OLYMPUS光學(xué)工業(yè)株式會社，型號：OLYMPUSU-LBD-2；超凈工作臺：蘇州安泰空氣凈化有限公司，型號：SW-CJ-Fl；石蠟包埋機(jī)：沈陽龍首電子儀器有限公司，型號：L-100；石蠟切片機(jī)：德國SLEE公司；超低溫冰箱：日本三洋公司，型號：MDF-328；恒溫箱：Eppendorf德國；電子天平：JA1003，Pharmacia Bioteeh，Britain。

1.5 分組與造模 將100只大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、中藥組、力爾凡組、聯(lián)合用藥組共5組，每組20只。參照文獻(xiàn)［2］方法改進(jìn)。艾氏腹水癌細(xì)胞株每周傳代1次，取荷瘤7 d的Wistar大鼠，抽取小量腹水，置于消毒的干試管內(nèi)，鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類計數(shù)。以生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)腫瘤細(xì)胞濃度至5×107/mL。用臺盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞存活性，提示活細(xì)胞數(shù)>95%時，再抽取腹水放入無菌容器內(nèi)，置冰塊上保存，以上法稀釋調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108/mL。大鼠以25%烏拉坦麻醉后，將大鼠右側(cè)背部用刮刀脫毛，局部常規(guī)消毒，用穿刺針自大鼠右側(cè)腋后線與第11、12肋間交點(diǎn)處垂直刺入，當(dāng)針頭刺入胸膜腔時感覺有落空感后注入0.3 mL上述腫瘤細(xì)胞懸液。共造模80只。正常對照組用同樣方法胸腔注射生理鹽水0.3 mL。

1.6 給藥方法 正常對照組及模型組：予3 mL生理鹽水灌胃，每日1次。中藥組：按生藥量16.14 g/（kg·d）灌胃瀉肺逐飲湯，每日 1次。 力爾凡組：力爾凡用生理鹽水 1∶1稀釋，按 1 mg/（kg·d），于造模后1、3、5、7 d，腹腔注射。聯(lián)合用藥組：按生藥量16.14 g/（kg·d）灌胃瀉肺逐飲湯，并予力爾凡以生理鹽水 1∶1稀釋，按1 mg/（kg·d），于造模后 1、3、5、7 d，腹腔注射。 各組給藥時間均為7 d。

1.7 標(biāo)本采集與檢測 在造模后的第8日，將大鼠以25%烏拉坦麻醉后，頸動脈放血處死，每組處死12只。（1）大鼠惡性胸腔積液的采集：以75%乙醇消毒后切開皮膚，在胸前區(qū)右側(cè)第9肋間隙處以眼科鑷鈍性分離胸肌達(dá)胸腔內(nèi)，游離膈肌腹面，小心地暴露右側(cè)胸腔，自膈肌腹面向右側(cè)胸腔進(jìn)針，用5 mL注射器盡量抽取胸腔積液。觀察胸腔積液外觀，并記錄各組大鼠胸腔積液量，精確到0.1 mL。同時每只鼠收集2 mL胸液，以4℃、2500 r/min離心15 min，取上清液置于4℃恒溫箱內(nèi)保存待測。（2）大鼠胸膜組織的采集：處死大鼠后，剪開右側(cè)胸腔，剪取壁層胸膜，固定于4%多聚甲醛固定液中，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切成4 μm厚的切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)改變。組織標(biāo)本制作固定后72 h內(nèi)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色法檢驗。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，等級資料采用χ2檢驗；組間比較用多樣本方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠胸水TGF-β1免疫組化結(jié)果 見表1。正常對照組大鼠胸水TGF-β1少量表達(dá)，各治療組胸水中癌細(xì)胞間質(zhì)上均有表達(dá)。

表1 各組大鼠胸水TGF-β1免疫組化結(jié)果比較n（%）

2.2 各組大鼠胸膜組織TGF-β1免疫組化結(jié)果 見表2。正常對照組大鼠胸膜組織TGF-β1少量表達(dá)，各治療組胸膜中癌細(xì)胞均有表達(dá)。

表2 各組大鼠胸膜TGF-β1免疫組化結(jié)果比較（±s）

表2 各組大鼠胸膜TGF-β1免疫組化結(jié)果比較（±s）

與力爾凡組比較，△P＜0.05；與聯(lián)合用藥組比較，▲P＜0.01。

組 別正常對照組n 12累積光密度值5.166±1.114模型組 12 21.620±5.893中藥組 12 15.603±5.597**△▲力爾凡組 12 18.685±6.822*▲聯(lián)合用藥組 11 9.644±2.743**

3 討 論

TGF-β是一組具有多種調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，對細(xì)胞的生長、分化、凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)合成和免疫反應(yīng)等有著廣泛影響［3］。TGF-β1對腫瘤細(xì)胞的生長具有雙向調(diào)節(jié)作用。腫瘤早期，TGF-β1能夠抑制c-myc基因表達(dá)的，使腫瘤細(xì)胞的生長停滯在G1期，而在腫瘤的晚期，由于機(jī)體對TGF-β1反應(yīng)性降低，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞過度生長，TGF-β1對于T細(xì)胞的免疫抑制作用，也造成了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。加之，TGF-β1可以促進(jìn)腫瘤血管的形成，促進(jìn)了腫瘤的過度生長。研究表明，TGF-β1還是一種致纖維化因子，可以促進(jìn)胸膜組織的纖維化［4］。

本實驗結(jié)果顯示：模型組大鼠胸水中TGF-β1含量高于各治療組，與中藥組、力爾凡組、聯(lián)合用藥組比較差異顯著（P＜0.05或0.01）；力爾凡組、中藥組與聯(lián)合用藥組比較無差異（P＞0.05）。模型組大鼠胸膜組織中TGF-β1含量高于各治療組，與中藥組和聯(lián)合用藥組比較有顯著差異（P＜0.01）；中藥組含量低于力爾凡組（P＜0.05）；聯(lián)合用藥組含量明顯低于中藥組和力爾凡組（P＜0.01）。模型組大鼠胸水和胸膜組織中的TGF-β1含量高，提示了在惡性胸腔積液和組織中TGF-β1出現(xiàn)高表達(dá)，證實了TGF-β1對晚期的惡性腫瘤具有促進(jìn)作用。而瀉肺逐飲湯能夠降低胸水和胸膜組織中的TGF-β1含量，說明瀉肺逐飲湯能降低惡性腫瘤組織TGF-β1的表達(dá)，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

［1］Sahn SA.Management of malignant pleural effusions［J］.Monaldi Arch Chest Dis，2001，56（5）：394-399.

［2］蔣鵬娜.逐飲I號對惡性胸水大鼠血清TUM2-PK和胸膜組織bFGF 的影響［D］.哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2008：26.

［3］Scott A，Sasse-Martin RJ，Gary DK.Pleural fluidtransforming growth factor-beta1 correlates with pleural fibrosis in experimental empyema［J］.Am J Respir Crit Care Med，2003，168（6）：700.

［4］Chen CH，Seguin-Devaux C，Burke NA，et al.Transforming growth factor beta blocks Tec kinase phosphorylation，Ca2+influx，and NFATc translocation causing inhibition of T cell differentiation［J］.J Exp Med，2003，197（12）：1689-1699.